Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İnsan Hassas Kesimli Akciğer Dilimlerinin (PCLS) Genel Hazırlanması ve Daha Sonra Kimyasallara Maruz Kalması
>NOT: Bir akciğeri doldurmak için iki kişi gereklidir. Hepatit A ve B için güncel bir aşı kaydı önerilir. Hastalar akciğer nakli öncesinde rutin olarak hepatit C virüsü (HCV) ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) açısından taranır. Mycobacterium tuberculosis ile aktif bir enfeksiyon teşhis edilirse veya şüphelenilirse, akciğer reddedilmelidir. Bununla birlikte, tüm taze insan akciğer dokusu ve ondan elde edilen numuneler potansiyel olarak bulaşıcı olarak ele alınmalı ve personelin iş güvenliğini sağlamak için ilgili koruyucu önlemler alınmalıdır (partikül filtreli maskeler (FFP2), koruyucu gözlük, eldivenler). İşlem 60 - 90 dakika sürer.
- İnsan akciğer lobunun sağlamlığını onaylayın.
not: Akciğer zarındaki bir yırtık, dokunun homojen bir şekilde dolmasını engeller. İnsan akciğer materyali rezeksiyon gününden itibaren olmalıdır. Buz üzerinde agaroz ile doldurulmadan önce oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 2 saatlik saklama süreleri tolere edilir. Bu protokolde kullandığımız doku rezeksiyon yapılan hastalardan elde edilmektedir. Ölen hastalardan değil. Doku buz üzerinde saklanmışsa, doldurmadan önce RT'ye önceden ısıtın, aksi takdirde agaroz hemen polimerize olur ve homojen bir doldurma mümkün olmaz.
Dikkat: Yerli insan materyaliyle temas eden tüm kişilerin laboratuvar önlüğü, iki çift eldiven, şapka, yüz maskesi ve bir çift koruyucu gözlükten oluşan koruyucu giysiler giydiğinden emin olun. İnsan materyali potansiyel olarak bulaşıcıdır.
- 7.5 g düşük jelleşen agarozu tartın ve 250 mL bi-damıtılmış suya ekleyin. Agaroz eriyene kadar agarozu bir mikrodalgada kaynatın. Agarozun erime ve jelleşme noktasına bağlı olarak yaklaşık 40 °C'ye soğutun.
not: Lob boyutuna bağlı olarak birkaç şişe gereklidir.
- Kültür ortamını (Malzeme Tablosu) önceden ısıtın ve 37 °C.
not: Agaroz çok sıcaksa, kültür ortamındaki vitaminler etkinliğini kaybeder ve hücreler zarar görür. Ortam/agaroz çözeltisinin sıcaklığı 37 °C'nin altındaysa, jelleşme işlemi başlayacak ve akciğerin homojen doluluğunu bozacaktır. Yalnızca 37 °C ila 39 °C arasında bir sıcaklık aralığı önerilir.
- Başlamadan önce gerekli tüm malzemeleri elinizin altına yerleştirin: 5 - 10 kelepçe, yaklaşık 1 m uzunluğunda esnek bir kateter, kateter bağlantısına uyan uygun bir şırınga (örn. 50 mL) ve buzla dolu bir buz kutusu.
- Silikon tüpü yerleştirerek ve tüpe paralel yönlendirilmiş bir kelepçe ile sabitleyerek trakea/ana bronşu kanül edin, böylece kelepçe dokuyu silikon tüpün yanında sıkıştırmadan birlikte sıkıştırır. Silikon tüpün içeriye sabitlendiğini ve doldurma işlemi sırasında kaymadığını doğrulayın. Diğer tüm bronşları, kan damarlarını ve yaralanmaları kelepçelerle kapatın, böylece doldurma işlemi sırasında agaroz dışarı sızmaz.
- Eşdeğer hacimde %3 düşük jelleşen agarozu bir beherde kültür ortamı ile karıştırın. Karışımı 50 mL'lik bir şırınga kullanarak akciğere damlatın. Şırıngayı orta ile yeniden doldurmadan önce, hava kabarcıklarını ve agaroz reflüsünü önlemek için kateteri parmaklarınızla veya bir kelepçeyle kelepçeleyin. Akciğer lobunu tamamen şişene kadar doldurun. Yan taraftaki akciğer plevrasına dikkatlice dokunun; Plevra eşit ve sert olmalıdır.
not: Akciğer lobunun boyutuna bağlı olarak, 2 veya 3 L'ye kadar agaroz / orta çözelti gerekebilir.
- Tek bir örnekte birden fazla bronş olması durumunda her bronş için 1.5 - 1.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Damlatılan agaroz miktarına bağlı olarak, agarozun jele polimerizasyonu için akciğeri 20 - 40 dakika boyunca buza koyun. Sert ve soğuk olup olmadığını kontrol etmek için plevraya birkaç tarafa dikkatlice dokunun, polimerizasyonun tamamlandığını gösterir, aksi takdirde beklemeye devam edin. Patologlar akciğeri dilimler halinde kesecek, örneklerini alacak ve akciğer materyalini nakliye için buz üzerinde saklayacaktır.
- İnsan akciğer dokusunu keskin bir bıçakla 3-5 cm'lik plakalar halinde kesin.
not: Keskinliği sağlamak için her akciğer için yeni bir bıçak kullanın.
- Doku dilimleyiciyi 400 mL buz gibi Earle'ün dengeli tuz çözeltisi (EBSS) ile doldurun. Tercih edilen çapta (örn. 8 mm; 10 mm) bir karot aleti ile yarı otomatik bir tornavida kullanarak silindirik doku çekirdeklerini akciğer plakalarından hemen kesin.
not: Bu çap, makinenin içindeki doku tutucunun çapına eşdeğer olmalıdır.
- Akciğer dilimlerinin kalınlığını istenen kalınlık değerine ayarlayın.
not: PCLS deneylerinde yaygın olarak yaklaşık 250 μm'lik bir kalınlık kullanılmaktadır. Doku dilimleyicinin üreticisi, dilim kalınlığının doğrulanması için Doku Dilimi Kalınlık Ölçerini önerir. Alternatif olarak, Brismar ve ark. tarafından tarif edildiği gibi dilim kalınlığını belirlemek için konfokal mikroskopi ile birleştirilmiş tam montajlı boyama kullanılabilir.
- Doku çekirdeklerini doku dilimleyicinin doku tutucusuna aktarın. Ağırlığı (doku tutucunun bir kısmı) doku çekirdeğinin üzerine koyun. Doku dilimleyicide kol hızını ve bıçak hızını 6'ya ayarlayın. Doku çekirdeğini PCLS'ye dilimlemeye başlayın.
- Ticari olarak temin edilebilen Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unun (DMEM) 500 mL'sini tamamlayın: 5 mL penisilin (10.000 birim / mL) ve streptomisin (10.000 μg / mL) ile Besin Karışımı F-12 DMEM / F12 (1: 1). Kültür ortamını steril koşullar altında birkaç gün buzdolabında saklayın. Yalnızca ortamın gerekli hacmini önceden ısıtın.
not: Penisilin 37 °C'de daha uzun süre tutulursa etkisiz hale gelir. Serum bileşimi partiden partiye değiştiğinden ve fenol-kırmızı gibi boyalar tahlillerle etkileşime girebileceğinden, serumsuz ve boyasız kültür ortamı kullanın.
- Bir Petri kabını (100 x 15 mm) 25 mL buz gibi soğuk kültür ortamı ile doldurun. Ortam, cam silindirin kelepçesi açılarak doku dilimleyiciden bir behere boşaltılmalıdır. Dilimleri bir beherden bir aplikatör (örneğin, aşılama döngüsü) kullanarak kültür ortamı ile Petri kabına aktarın. Petri kabını bir inkübatöre koyun (37 °C, %5 CO2, %100 nem). Yıkama adımlarından önce ortamın ısınmasına izin verin.
not: Diğer tüm adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilir.
- PCLS'yi yıkamak için Petri kabına bir hücre süzgeci yerleştirin. Kültür ortamını hücre süzgecinden 10 mL'lik serolojik bir pipetle tamamen çıkarın ve 25 mL 37 °C önceden ısıtılmış taze ortam ekleyin. Bu adımı her 30 dakikada bir 3 - 4 kez tekrarlayın.
not: Hücre süzgeci, dilimlere herhangi bir zarar vermemek için dilimlerin pipete emilmesini önler.
- Akciğer dilimlerini, oyuk başına iki dilim için en az 500 μL kültür ortamı olan 24 oyuklu bir kültür plakasına dikkatlice aktarın. Akciğer dokusunu maddelere maruz bırakın (bkz. adım 3.1 - 3.4), ör. 37 °C'de 24 saat boyunca, %5 CO2.
not: Transfer için, tercihen bir aşılama halkası kullanın ve doku hasarını önlemek için dilimlerin ilmek üzerinde yüzmesine izin verin. Dilimlerin daha fazla ayrılmasına gerek yoktur, çünkü yalnızca yeterli taze ortam eksikliği doku dilimlerinde hücre ölümüne neden olacaktır. Dilimler kuyuda üst üste gelebilir veya birbirine dokunabilir: bunun doku canlılığı üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
- Artık tüm insan malzemesini en az 24 saat boyunca sabitleyici (örneğin, %10 tamponlu formaldehit) içeren plastik bir şişeye koyun ve bunu bertaraf sürecinde yakın.
Dikkat: Formaldehit toksiktir, bu adımı bir başlık altında gerçekleştirin.
2. Maddeler için Çözeltilerin Hazırlanması
>NOT: Kullanmadan hemen önce çalışma solüsyonlarını ve kontrollerini hazırlayın.
DİKKAT: Maddeleri güvenlik talimatlarına göre veya bilinmiyorsa potansiyel olarak zararlı olarak ele alın ve rutin güvenlik önlemlerini izleyin.
- Suda çözünür maddeleri doğrudan kültür ortamında çözün. Çözünmeyen veya az çözünen kimyasallar için, önce maddenin çözünürlüğüne bağlı olarak maddeyi uygun çözücüler içinde çözün. Suda çözünürlüğü sınırlı olan (<0.1 mg / mL) maddeler, örneğin dimetil sülfoksit (DMSO) veya etanol içinde çözülebilir. Toksik olmayan çözücü konsantrasyonları önceden titrasyon ile belirlenmelidir. Maddenin ortama seyreltildiğinde çözeltiden çökelmediğinden emin olun.
NOT: amonyum hekzakloroplatinat (HClPt) ve sodyum lauret sülfat (SLS) çözeltileri hazırlanır.
- Kültür ortamında veya çözücüde istenen en yüksek konsantrasyonun 100 katında madde stok çözeltileri hazırlayın. 12.5 mg HClPt ve 34.4 mg SLS tartılır ve kimyasallar 1 mL kültür ortamında çözülerek stok çözeltileri hazırlanır.
not: Bu kimyasallar için herhangi bir çözücüye gerek yoktur.
- Önceden ısıtılmış bir ortamda 1:100'lük son bir seyreltme hazırlayın. Çözücünün önceden kullanılması durumunda, bu yaklaşım tüm madde konsantrasyonları için aynı nihai çözücü konsantrasyonu ile sonuçlanır.
- PCLS'nin referans tedavisi için nihai çözücü konsantrasyonunu (örneğin, adım 3.3'te açıklandığı gibi% 1) kullanın. Sonuçlar bölümünde belirtilen kimyasallar için herhangi bir solvent kontrolüne gerek duyulmamıştır.
3. Sitotoksisite Deneyleri için Pozitif ve Negatif Referanslar
- Tüm canlılık testleri için aşağıdaki pozitif ve negatif kontrolleri hazırlayın:
- Doku kontrolü: PCLS'yi hücre kültürü koşullarında (37 °C, %5 CO2, %100 nem) 24 saat boyunca tedavi edilmemiş PCLS için bir referans olarak bir kültür ortamında inkübe edin.
- Araç kontrolü (gerekirse): hücre kültürü koşullarında (37 °C, %5 CO2, %100 nem) 24 saat boyunca sadece araçla muamele edilen PCLS için referans olarak PCLS'yi nihai çözücü konsantrasyonu ile inkübe edin (bkz. adım 3.4).
- Pozitif kontrol: PCLS'yi tampon çözelti içinde %1 deterjan ile 4 °C'de 1 saat inkübe edin.
not: PCLS renksiz hale gelirse, doku ölür. Toplam L-laktat dehidrojenaz (LDH), süpernatantta yaklaşık 1.9 - 2.3'lük bir absorpsiyon ile belirlenir. Doku, yaklaşık 0'lık bir absorpsiyon ile WST-1 testi için kullanılır.
4. Suda Çözünür Tetrazolyum Tuzu (WST-1) ile İnsan PCLS'sinde Kimyasal Olarak İndüklenen Sitotoksisitenin Ölçümü Deney
NOT: WST-1 testi, kuyucuk başına iki PCL ile 24 oyuklu bir plakada gerçekleştirilir. Tercihen, her parametre için kopyalar kullanın ve ölçümden sonra bu kopyaların sonuçlarını bir havuzda toplayın.
- Başlamadan hemen önce WST-1 reaktifini ortamda seyrelterek çalışma çözeltisini hazırlayın. Gerekli çalışma çözeltisi miktarı, 24 oyuklu bir plakanın 250 μL/kuyusudur. Bu nedenle, bir kuyucuk için 25 μL reaktifi 225 μL kültür ortamı ile karıştırın.
- PCLS'nin adım 1.16'dan itibaren inkübe edilmesinden sonra, süpernatanı sitokin ölçümleri veya LDH testi gibi diğer testler için atın veya kullanın. Kalan doku bir sonraki adım için kullanılır.
- Oyuk başına WST-1 reaktifinin çalışma konsantrasyonundan 250 μL pipetleyin ve plakayı 1 saat boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin. İnkübasyon sırasında PCLS'nin WST-1 reaktifi tarafından tamamen kaplandığından emin olun.
- Plakayı bir orbital çalkalayıcı (200 rpm) üzerine yerleştirin ve WST-30 reaktifinin iyice karışmasını sağlamak için 1 saniye boyunca dikkatlice çalkalayın. Yeni bir düz tabanlı 96 oyuklu plaka alın ve 24 oyuklu plakanın her bir oyuğunun süpernatantından kopyalar halinde 100 μL pipetleyin.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun absorpsiyonunu 450 nm'de (referans: 630 nm) ölçün. 630 nm'deki emilimi 450 nm'den çıkarın. not: Sitotoksisite değerlendirmesi için güvenilir veriler sadece canlı dokudan elde edilebilir. Bu nedenle yayınlanan bu kabul kriterlerinin her deneyde karşılanması gerekmektedir. Bu kriterler karşılanmazsa deney tekrarlanmalıdır.
- İşlenmemiş ortam kontrolünün absorpsiyonu 0.6'nın üzerinde olmalıdır, aksi takdirde deney tekrarlanmalıdır. Veriler bu gereksinimi karşılıyorsa, doku kontrolünün absorpsiyon değerini %100'e ayarlayın ve doku kontrolüne göre tedavi edilen numunelerin WST-1 azaltımını hesaplayın.
