İmmünomodülatör Bileşiklerin Taranması için Tasarlanmış Lenfositlerin Kullanıldığı Floresan Bazlı Bir Test

Abstract

Kaynak: Fouda, A., et al., Küçük Moleküllerin Yüksek Verimli Taraması için Uygun Floresan Bazlı Lenfosit Testi. J. Vis. Uzm., (2017).

Bu video, floresan bazlı test yoluyla immünomodülatör bileşiklerin taranmasını göstermektedir. Yeşil floresan protein ekspresyon kasetlerine sahip transgenik fare kaynaklı T lenfositleri bu bileşiklerle tedavi edilir. Geliştirilmiş ve azaltılmış GFP sinyalleri, sırasıyla bileşiklerin uyarıcı ve inhibitör etkilerinin tanımlanmasını sağlar.

Protocol

1. Splenosit Ortamının ve Akış Sitometri Tamponunun Hazırlanması

1. Tüm adımları %70 etanol ile temizlenmiş bir biyolojik başlık altında gerçekleştirin.
2. 70 mL önceden ısıtılmış Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x medium'u (ticari olarak temin edilebilir ve filtrelenmiş 500 ml hacimli steril şişelerde tedarik edilir) çıkarın ve steril bir tüpe koyun. Kaldırılan ortam daha sonra protokolde kullanılacaktır.
3. Kalan 430 mL RPMI 1640 1x'i 50 ml inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 5 mL penisilin / streptomisin, 5 mL N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (HEPES), 5 ml esansiyel olmayan amino asitler, 5 ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nur77GFP fareler	Jackson Laboratuvarı	Fare suşu No. 016617	Hayvan tesisimizde bir kurum içi koloni kuruldu
96 kuyu-U kültür plakası, steril	VWR Uluslararası	10062-902	Manyetik boncukları kullanarak T hücresi aktivasyonu
70μm hücre süzgeci, steril	Corning A.Ş.	352350	Splenosit hücre süspansiyonunun oluşturulması
5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpler, steril	Corning A.Ş.	352058	Splenosit hücre süspansiyonunun oluşturulması
50 ml polipropilen konik tabanlı borular, steril	VWR Uluslararası	89039-656	Splenosit hücre süspansiyonunun oluşturulması
10 ml iğnesiz şırınga, steril	Becton, Dickinson ve Şirketi	305482	Dalağı ezmek için
5 ml hücre kültürü kabı, steril	Greiner Bio-Bir	627 160	Dalağı ezmek için
Penisilin- Streptomisin (10.000 U/mL)	WISENT A.Ş.	450-200-EL	Splenosit ortamının bileşeni
Sodyum bikarbonat ve L-glutamin ile RPMI 1600	WISENT A.Ş.	350-002-CL	Splenosit ortamının bileşeni
MEM esansiyel olmayan amino asitler	WISENT A.Ş.	321-010-EL	Splenosit ortamının bileşeni
HEPES serbest asit 1 M	WISENT A.Ş.	330-050-EL	Splenosit ortamının bileşeni
Sodyum piruvat çözeltisi (100mM)	WISENT A.Ş.	600-110-EL	Splenosit ortamının bileşeni
Fetal Sığır Serumu (FBS)	WISENT A.Ş.	080-910	Splenosit ortamının bileşeni ve akış-sitometri tamponu
Fosfat tamponlu salin (PBS)	WISENT A.Ş.	311-010-CL	Akış sitometrisi tamponunun bileşeni
2-Merkaptoetanol (55mM)	Thermo Fisher Bilimsel	21985-023	Splenosit ortamının bileşeni
T- Hücre izolasyon kiti	Kök Hücre Teknolojileri	19851	T hücrelerini izole etmek için
Fare T-Aktivatör CD3 / CD28 süperparamanyetik boncuklar	Thermo Fisher Bilimsel	11452D	T hücrelerini etkinleştirmek için
Hücre izolasyon mıknatısı	Kök Hücre Teknolojileri	18000	T hücrelerini izole etmek ve manyetik boncukları çıkarmak için
Rekombinant Murin IL-7	Peprotech teknolojisi	217-17	Aktivasyon sırasında T hücresinin hayatta kalmasını desteklemek için
Anti-fare CD3 antikoru	BD Pharmingen	561799	Akış sitometrisi için T hücrelerini boyamak için
Biyomed FXp	PerkinElmer A.Ş.	A31842	24 saatlik inkübasyondan sonra hücreleri yeniden askıya almak için
Opera Phoenix Yüksek İçerikli Gösterim Sistemi	PerkinElmer A.Ş.	HH14000000	GFP/Hoechst sinyalini analiz etmek için