1. Splenosit Ortamının ve Akış Sitometri Tamponunun Hazırlanması
- Tüm adımları %70 etanol ile temizlenmiş bir biyolojik başlık altında gerçekleştirin.
- 70 mL önceden ısıtılmış Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x medium'u (ticari olarak temin edilebilir ve filtrelenmiş 500 ml hacimli steril şişelerde tedarik edilir) çıkarın ve steril bir tüpe koyun. Kaldırılan ortam daha sonra protokolde kullanılacaktır.
- Kalan 430 mL RPMI 1640 1x'i 50 ml inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 5 mL penisilin / streptomisin, 5 mL N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (HEPES), 5 ml esansiyel olmayan amino asitler, 5 mL sodyum piruvat ve 0.05 mL filtrelenmiş (1M) 2-merkaptoetanol ile destekleyin.
not: Hücrelerin ısının şok etmesini önlemek için 37 ºC'ye ayarlanmış bir su banyosu kullanarak splenosit ortamını önceden ısıtın. Bu, hücresel apoptozun indüksiyonunu önlemek için önemlidir.
- Akış sitometrisi tamponunu hazırlamak için, 98 ml fosfat tamponlu saline (PBS) 2 mL FBS ekleyin ve kullanıma kadar (tercihen üç gün içinde) buzdolabında saklayın.
2. Nur77GFP Fare Dalaklarından Splenosit Hücre Süspansiyonu Üretimi
- Dalağı 6-8 haftalık dişi bir Nur77GFP faresinden aseptik olarak izole edin.
- Bunu başarmak için steril bir başlık altında çalışın. Kurban edilen fare kürkünü, makası ve forsepsleri %70 etanole batırın.
- Fareyi sağ tarafına yatırın ve sol üst karın kadranındaki cildi ve kasları kesin. Dalağı gözle görülür bir şekilde bulmak için kesi alanını inceleyin ve ardından kesin. Bir sonraki adımı gerçekleştirmeye hazır olana kadar dalağı buz üzerinde splenosit ortamında tutun.
- Dalak (lar) ı 5 ml önceden ısıtılmış splenosit ortamı içeren 10cm'lik 2 hücreli kültür petri kabına yerleştirin.
- Çözelti bulanıklaşana kadar steril bir şırınga pistonu kullanarak dalağı ezin. İşlemin sonunda bir dalak kollajen matrisi kalmalıdır.
- Splenosit ortamında kapsamlı ezme işleminden sonra, hücre süspansiyonunu toplayın ve herhangi bir kalıntı veya pıhtıyı filtrelemek için 50 mL'lik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
- 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini 2-3 mL evde üretilen veya ticari kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Pipetlemeden sonra (2-3 kez) süspansiyonu 20-30 saniye dinlendirin.
- 5 mL PBS veya tercih edilen uygun bir tampon ekleyin, ardından hücre süspansiyonunu 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın (parçalanmış kırmızı kan hücreleri içerdiğinden kırmızı renkte olmalıdır) ve hücre peletini 2 ml splenosit ortamında yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak, canlı ve ölü (nekrotik) hücreleri ayırt etmek için tripan mavisi ile boyanmış hücrelerin sayısını sayın.
3. Splenosit Hücre Süspansiyonundan T Hücresi İzolasyonu
- Hücre süspansiyonunu 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.10 x 106 hücre / mL'lik bir hücresel konsantrasyon elde etmek için hücreleri serumsuz RPMI ortamında (adım 1.3'ten 50 ml) yeniden süspanse edin.
- Hücreleri 5 mL'lik bir polistiren tüpe aktarın ve saflaştırma adımının sonunda saflık değerlendirmesi / karşılaştırması için 100 μL'lik bir splenosit alikotunu bir kenara koyun.
- 50 μL / mL'de hücre süspansiyonuna normal sıçan serumu ve ardından bir T hücresi izolasyon antikor kokteyli (50 μL / mL) ekleyin.
- Hücre süspansiyonunu karıştırın ve 10 dakika dinlendirin. Bu adım, antikor kokteylinin tüm istenmeyen hücreleri bağlamasına izin verir.
- Streptavidin hızlı kürelerini (manyetik boncuklar) 2,5 dakika ekleyin, ardından serumsuz ortamı kullanarak hacmi 2,5 mL'ye getirin.
- Tüpü 3 dakika boyunca bir hücre izolasyon mıknatısına yerleştirin.
- Mıknatısı tutarak ve çözeltiyi tek hamlede dökerek T hücresi süspansiyonunu yeni bir polistiren tüpe aktarın.
not: İzole edilmiş süspansiyon, saflaştırılmış T hücrelerini içerir. İstenmeyen tüm hücreler, manyetik streptavidin boncuklarına bağlı tüpün yanında tutulur.
- İzole edilmiş T hücrelerini tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak sayın.
not: Bu adımda, izole edilen T hücrelerinin saflığı, akış sitometrisi ile T hücresi izolasyonundan önce ve sonra CD3 + olaylarının yüzdesi analiz edilerek doğrulanabilir (isteğe bağlı).
- Kısaca 1 ml splenosit hücre süspansiyonunu 500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 1 x 106 hücre / mL konsantrasyonda bir akış sitometrisi tamponunda askıya alın.
- 1:100 konsantrasyonda floresan etiketli anti-fare CD3 antikoru ekleyin. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Bir kez yıkayın, santrifüjleyin ve akış sitometrisi ile analiz için akış sitometrisi tamponunda (400 μL) yeniden askıya alın.
4. T hücresi Aktivasyonu ve yeşil floresan protein (GFP) İfadesinin İndüksiyonu
- T hücrelerini, süspansiyon halinde, 2.5 x 105 hücre / kuyucuk konsantrasyonunda yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın.
- 2 ng / mL'de rekombinant interlökin (IL) -7 ve CD3 / CD28 manyetik boncuklar (25 μL / 106 hücre) ekleyin. Aktive edilmemiş T hücrelerini temsil eden daha sonraki ölçümler için negatif bir kontrol görevi görmek üzere T hücrelerinin bir kısmını boncuklarla tedavi edilmeden tutun.
- On iki saat sonra, herhangi bir boncuk hücresi kompleksini / agregasını kırmak için her bir oyuktaki hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek 96 oyuklu plakadan T hücrelerini hasat edin. Süspansiyonu tüm kuyucuklardan 5 mL'lik bir polistiren tüpe toplayın.
- Süspansiyonu içeren tüpü, daha önce T hücrelerinin saflaştırılması için kullanılan aynı hücre izolasyon mıknatısının içine yerleştirin ve 5 dakika dinlenmeye bırakın.
- Mıknatısı tutarak ve çözeltiyi tek hamlede dökerek T hücresi süspansiyonunu yeni bir polistiren tüpe aktarın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. 2 x 106 hücre / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için hücreleri taze splenosit ortamında yeniden askıya alın.
- Aktive edilmemiş T hücrelerine kıyasla stimülasyondan 12 ila 24 saat sonra akış sitometrisi (kalite kontrol için isteğe bağlı) ile GFP ekspresyon yoğunluğunu değerlendirin. 12
not: GFP floresansı, Nur77GFP T hücrelerine özgüdür ve T hücresi reseptörü TCR'nin başarılı bir şekilde aktivasyonu üzerine ortaya çıkar.
- Mikroskopi ile canlılık ve aktivasyonun (isteğe bağlı) değerlendirilmesi için, aktive edilmiş hücreleri analizden 30 dakika önce 0.2 μg / ml'lik bir konsantrasyonda Hoechst ile boyayın. Bir kapak slaytına veya düz tabanlı siyah kenarlı 384 oyuklu bir plakanın kuyusuna yeterli miktarda hücre süspansiyonu ekleyin ve canlı hücreleri değerlendirmek için bir floresan mikroskobu altında inceleyin. Ölü hücreler nükleer lekelenmeyi tutmaz.
5. Küçük Moleküllerin Yüksek Verimli Taraması (HTS)
- Aktive edilmiş T hücrelerinin (manyetik boncuklar veya antikorlar / CD40L) veya aktive edilmemiş grupların 2 x 106 hücresi / mL'sinde bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
- 384 oyuklu bir plakada (40 μL hacim) 75.000 hücre / kuyu plakası. Hoechst boyası kullanarak floresan mikroskobu (HTS'den önce isteğe bağlı kalite kontrol adımı) ile canlılık ve aktivasyon değerlendirmesi için düz tabanlı siyah kenarlı 384 oyuklu bir plaka veya mikroskop kapak lamı kullanın (ayrıntılar için adım 4.8'e bakın).
- Manuel olarak veya otomatik bir sistem kullanarak, her bir oyuğa tercih edilen ilaçları (% 0.5 dimetil sülfoksit, DMSO içinde çözülmüş) ekleyin.
- Aracı (DMSO) pozitif (aktif) ve negatif (aktif olmayan) kontrol kuyularına ekleyin. DMSO konsantrasyonunu maksimum% 0,5'e ayarlayın.
- Plakaları 37 ºC ve% 5 karbondioksit, CO2'de 24 saat (veya tercih edilen inkübasyon süresi) inkübe edin.
- Tarama gününde, Hoechst 33342 leke solüsyonunu seyreltin (1: 3,333; örneğin, toplam 50 μL'lik bir hacim oluşturmak için 384 oyuklu plakalardaki hücrelere 10 μL ekleyin). 0.2 μg / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için Hoechst çözeltisi ekleyerek GFP analizinden 30 dakika önce boyayın.
- Her kuyucukta homojen bir dağılım elde etmek için hücreleri nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
not: Bu adım, ilaçların otomatik bir sistem kullanılarak dağıtılması durumunda (adım 5.3) önemlidir, çünkü hücreler kuyunun bir tarafında, akış yönünün tersine birikme eğilimindedir.
- Plakaları oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 45 x g'da döndürün.
- Plakaları oda sıcaklığında 15 dakika dinlenmeye bırakın.
- Otomatik konfokal yüksek içerikli tarama (HCS) sistemini kullanarak plaka(lar) okumaları gerçekleştirin. Plakayı makineye yükleyin. Hedefi 40X veya daha yüksek büyütme oranına ayarlayın. Hoechst (UV lambası) için kamera #4'ü ve GFP (lazer 1) için kamera #488'i kullanın. Makineyi kuyucuk başına 6-10 alanı okuyacak şekilde ayarlayın. Makineyi, 488 nm'de (GFP'yi okumak için) ve UV ışığında (Hoechst'i okumak için) alan başına iki sıralı okuma yapacak şekilde ayarlayın. Hedefi 40X veya daha yüksek büyütme oranına ayarlayın.
not: Sistem, herhangi bir ayar gerektirmeyen bilgisayarlı bir mikroskoptur. Odak uzaklığı, gelen ışığın yoğunluğu ve pozlama süresinin tümü makine tarafından otomatik olarak ayarlanır.
