$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Cihaz kurulumu
NOT: Havada asılı kalan hücrelerin görüntülenmesi, bir manyetik alan oluşturmak için aynı kutup birbirine bakacak şekilde yerleştirilecek şekilde z ekseni üzerinde manyetize edilmiş iki nadir toprak neodimyum mıknatısı gerektirir. Mıknatıslar arasındaki mesafe, manyetik alanın yoğunluğuna ve hedeflerin yoğunluğuna bağlı olarak özelleştirilebilir. Bu durumda mıknatıslar, 50 mm uzunluğunda 1x1 mm kare cam kılcal borunun yerleştirilmesi için yeterli olan 1 mm'lik bir boşlukla ayrılır. Cihaz, istek üzerine temin edilebilen bir AutoCAD tasarımı kullanılarak 3D olarak basılmıştır.
- Mikroskobu yan yatırın, tamamen yatay.
not: Standart bir dik konuma yerleştirilmiş bir mikroskop, mıknatısların kondansatör ve objektife göre konumları nedeniyle havaya kalkan nesneleri görüntülemek için doğrudan uygun değildir. Bu sınırlama, mikroskobu yan yatırarak, kondansatörün ışığı kılcal damara odaklamasına izin veren mükemmel bir yatay ve objektif merceğin mıknatıslar arasında havaya uçan hücreyi görüntülemesine izin verirken, Köhler aydınlatma gereksinimlerini korurken atlanabilir.
- 2 veya 3 laboratuvar jakı kullanarak standı bir breadboard masası üzerinde destekleyin ve düzleştirin.
- Titreşimleri sınırlamak için, breadboard tablasını kauçuk sönümleme ayaklarıyla destekleyin.
- Sahneyi çıkarın ve havaya kaldırma cihazının yüksekliğini ayarlamak için kompakt bir laboratuvar jakı (y ekseni) ve iki tek eksenli öteleme aşaması ile değiştirin; biri odağı ayarlamak için (z ekseni) ve ikincisi kılcal boruyu taramak için.
- İki mini seri optik direk kullanarak manyetik kaldırma cihazını laboratuvar jakına takın.
2. Antikorun Karboksi-Mikropartiküllere/Boncuklara Bağlanması (PolyAn tarafından bir protokolden değiştirildi)
NOT: Rhesus, Rh(+) tespiti için yalnızca düşük yoğunluklu boncukların (1,05 g/mL) kaplanması gerekir, ancak hücre dışı veziküllerin tespiti için hem yüksek hem de düşük yoğunluklu boncukların kaplanması gerekir.
- 1 mg boncuk süspansiyonu eşdeğerini alın ve 0.5 mL Aktivasyon Tamponu (50 mM 2- (N-morfolino) etansülfonik asit, MES (MW195.2, 1 mL'de 9.72 mg)) pH 5.0 ve% 0.001 Polisorbat-20) ekleyin.
- 12 μL taze yapılmış 1.5 M 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC) (MW 191.7, 1 mL'de 0.28755 g) ve 12 μL 0.3 M Sülfo-N-Hidroksisüksinimit (NHS) (MW 217.14, 1 mL'de 0.0651 g) buz gibi soğuk suda.
- Tüpleri bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve boncuklar üzerindeki karboksil gruplarını aktive etmek için oda sıcaklığında 1 saat kuvvetlice çalkalayın.
- 0.5 mL Birleştirme Tamponu (10x fosfat tamponlu salin, PBS veya 0.1 M fosfat pH 7-9) ekleyerek aktivasyonu 1 saat sonra durdurun.
- Boncukları 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyerek peletleyin veya boncuklar peletlenemiyorsa, 0,45 μm'lik bir santrifüj tüpü filtresi kullanın. Süpernatanı veya akışı aspire edin.
- Boncukları 1 mL 10x PBS ile adım 2.5'teki gibi 3 kez yıkayın.
- Mg boncuk başına 25 μg antikor hesaplayın ve istenen antikoru aktive edilmiş boncuklarla 10X PBS'de 0.7-1.0 mg / mL nihai antikor konsantrasyonuna karıştırın.
- Tüpleri düşük hıza ayarlanmış bir tüp külbütöre yerleştirin. Birleştirme için boruları gece boyunca oda sıcaklığında nazikçe yuvarlayın.
- Adım 2.5'i tekrarlayın ve boncukları 1 mL 10x PBS ile iki kez yıkayın.
- 0.5 mL 1 M etanolamin (% 98 stok = 16.2 M) tampon pH 8.0'da% 0.02 Polisorbat-20 ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
- Adım 2.5'i tekrarlayın ve boncukları Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyunun (DPBS) 1 mL'sinde bir kez yıkayın. Boncuklar, ihtiyaç duyulana kadar 4 ° C'de 200 μL DPBS'de saklanabilir.
not: Protokol buradan duraklatılabilir.
3. Rh(+) tespiti için kan toplanması ve hazırlanması
- Tek tıklamalı bir delme cihazı kullanarak, bir Rh (+) donörün parmağını delin ve 10 μL kanı 1 mL DPBS'ye toplayın.
- Rh+ hücrelerini bir floresan plazma zarı boyası ile boyayın. İsteğe bağlı olarak, 1 mL Rh+ hücre süspansiyonuna (1:1000 seyreltme) 1 μL floresan boya ekleyin.
- Hücreleri floresan boya ile 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 15 saniye boyunca 5.600 x g'da döndürerek pelet haline getirin ve 1 mL DPBS kullanarak 3 kez yıkayın. Kalsiyum ve magnezyum (HBSS++) ile 1 mL Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) yeniden süspanse edin.
- Tek tıklamalı delme cihazını kullanarak, bir Rh (-) donörünün parmağını delin ve 2 μL kan toplayın.
not: 2'den fazla koşul hazırlıyorsanız, her tüpe 1 μL Rh (-) kan eklemek için yeterli kan toplayın.
- Gerekli deney tüplerini hazırlayın: Tek başına boncuklar, immünoglobulin G (IgG) kontrolü, örnek.
- Tek başına boncuklar: 174 μL HBSS++, 1 μL IgG kontrol boncuğu, 1 μL yüksek yoğunluklu boncuk (1,2 g/mL) ve 24 μL 500 mM Gd3+ (60 mM) ekleyin.
- IgG kontrolü: 172 μL HBSS++, 1 μL IgG kontrol boncuğu, 1 μL yüksek yoğunluklu boncuk, 1 μL Rh-kan, 1 μL lekeli Rh+ kan süspansiyonu ve 24 μL 500 mM Gd3+ ekleyin.
- Numune tüpü 172 μL HBSS++, 1 μL anti-RhD kaplı boncuklar, 1 μL yüksek yoğunluklu boncuklar, 1 μL Rh-kan, 1 μL lekeli Rh (+) kan süspansiyonu ve 24 μL 500 mM Gd3+.
not: Referans için Rh numunelerine yüksek yoğunluklu boncuklar eklenir.
4. Manyetik Levitasyon Cihazındaki Hücrelerin Analiz Edilmesi
- Cihaz başlatmayı üretici talimatlarına göre gerçekleştirin.
- Tüp dolana kadar 50 μL numuneyi bir kılcal tüpe yükleyin. Kılcal borunun uçlarını kılcal dolgu macunu ile kapatın ve hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- Kılcal boruyu üst ve alt mıknatıslar arasındaki tutucuya yerleştirin. Optimum görüntüleme için sahneyi ve odağı ayarlayın.
not: Hücrelerin/boncukların, yoğunluklarına ve Gd3+ konsantrasyonuna bağlı olarak manyetik denge konumlarına ulaşmaları 5-20 dakika arasında sürebilir. Gd3+ konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, süre o kadar kısa olur.