Desteklenen Düzlemsel Lipid Çift Katmanları ile T Hücresi Etkileşimini İncelemek İçin Bir İn Vitro Teknik

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Görüntü Analizi için CD4⁺ T Hücrelerinin İzolasyonu

1. Toplanan örneklerden 10,⁷ donmuş periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) veya lenf nodu mononükleer hücreleri (LNMC'ler) içeren 1 mL'lik bir alikotu çözün. Steril bir başlıkta, çözülmüş hücreleri penisilin / streptomisin ve glutamin ile desteklenmiş 9 mL RPM'ye ekleyin.
   1. Hücreleri 4 ° C'de 300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücreleri% 10 FBS (tam ortam) içeren 5 mL takviye RPMI'de yeniden süspanse edin. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de bir CO₂ inkübatöründe inkübe edin.
2. Ertesi gün, CD4 ⁺ T hücrelerini, üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak negatif immünomanyetik sıralama ile saflaştırın.
3. Taze saflaştırılmış CD4 ⁺ T hücrelerinin sayısını ölçmek için, 5 μL hücre süspansiyonunu eşit hacimde bir tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. Hücre-tripan mavisi karışımı olan bir hemositometre yükleyin ve hemositometrenin 5 bölümündeki canlı hücreleri sayın.
4. Hücre sayısının ortalamasını alın ve orijinal hücre süspansiyonundaki hücre sayısını belirleyin: hücre sayısı/1 mL = ortalama sayı x 2 x 10⁴. İzole edilmiş hücrelerin toplam sayısı çok küçükse, hücreleri saymadan olduğu gibi kullanın.
5. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve bir tahlil tamponunda (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2 HPO₄, 5 mM D-glikoz, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂ ve% 1 insan serum albümini) 10⁵ hücre / 50 μL veya daha azında ve hücreleri hazır olana kadar 4 ° C'de (1-2 saat boyunca) tutun. Deneylerde kullanın.
6. Tüm biyolojik atıkları ilgili kurumsal yönergelere göre atın.
7. Bir kontrol hücresi popülasyonu olarak istenirse, kordon kanı PBMC'den aktive edilmiş CD8 ⁺ T hücreleri hazırlayın, sırasıyla 10 μg / mL ve 1 μg / mL'de anti-CD3 ve anti-CD28 antikorlarının bir karışımı ile kaplı bir T25 kültür şişesine 5 mL tam ortama 10 7 hücre yerleştirin.
8. Ertesi gün, aktive edilmiş kordon kanı hücrelerini şişeden çıkarın, 1 kez taze tam ortamla yıkayın ve hücreleri 2 hafta boyunca rekombinant IL-2 (100 U / mL) varlığında genişletin.
9. Kordon kanı CD8 ⁺ T hücrelerini, üreticinin talimatlarına göre piyasada bulunan kiti kullanarak negatif immünomanyetik sıralama ile saflaştırın. Hücreleri sayın ve ortamı, LN ve PB CD8 ⁺ T hücreleri için adım 1.3-1.6'da açıklandığı gibi tahlil tamponuna değiştirin.

2. Düzlemsel Lipid Çift Katmanlarının Hazırlanması için Bileşenler

1. Başka bir yerde tarif edildiği gibi 3 çeşit lipozom hazırlayın: (a) 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin) lipozomlar, (b) 33 mol DOGS-NTA (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-[(N-(5-amino-1-karboksipentil)iminodiasetik asit) süksinil] (amonyum tuzu)) lipidleri içeren 0.4 mM DOPC lipozomları, (c) 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(kap biotin) (sodyum tuzu)).
2. Daha önce tarif edildiği gibi% 5 kazein çözeltisi hazırlayın.
   1. 5 g kazein tozunu 100 mL ultra saf suda çözün ve 350 μL 10 M sodyum hidroksit ekleyin. Her şeyi normal bir manyetik karıştırıcıda mevcut ölçeğe göre yavaş bir hızda, oda sıcaklığında 2 saat ve ardından gece boyunca 4 °C'de karıştırın. PH'ı 7.3'e ayarlayın ve çözeltiyi 4 °C'de 100.000 x g'da 2 saat boyunca ultrasantrifüj edin. Süpernatanı 0.22 μm steril bir filtre ile filtreleyin ve çözeltiyi -80 °C.
      'de alikotlarda saklayın Dikkat: Sodyum hidroksit çözeltisi kimyasal yanıklara neden olabilir ve gözlerle temasında kalıcı körlüğe neden olabilir. Bu kimyasalı veya solüsyonlarını kullanırken lastik eldiven, koruyucu giysi ve göz koruması kullanın.
3. Daha önce açıklanan bir yaklaşımla mono-biyotinile antikor molekülleri üretmek için anti-CD3 antikorlarını biyotin ile etiketleyin.
   1. 0.1 mg / mL'de dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir Biotin-PEO4-NHS çözeltisi hazırlayın. 100 mM sodyum bikarbonat içeren 0.5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 mg antikora 3.7 μL Biotin-PEO4-NHS çözeltisi ekleyin.
   2. Karışımı oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. DMSO'da 10 mg / mL'de bir Alexa Fluor 488 NHS ester çözeltisi hazırlayın. Alexa Fluor 488 NHS ester çözeltisini, 10 kat azı dişi fazlalıkta Biotin-PEO4-NHS tarafından etiketlenen antikora ekleyin.
   3. Karışımı, normal bir manyetik karıştırıcı üzerinde yavaşça karıştırarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Boyut dışlama kromatografisi kullanarak bağlanmamış boyayı ayırın.
   4. Antikor çözeltisinin optik yoğunluğunu 280 nm'de (A280) ölçerek antikor konsantrasyonunu belirleyin. Etiketli antikorların optik yoğunluğunu 577 nm'de (A577) ölçün.
   5. Aşağıdaki denklemi kullanarak boya-antikor oranını belirleyin:
      
      not: Üreticinin protokolünde daha fazla ayrıntı bulabilirsiniz.
4. Daha önce tarif edildiği gibi bir Drosophila ekspresyon sisteminde rekombinant çözünür bir Hücreler Arası Adezyon Molekülü 1 (ICAM-1) proteinini eksprese edin.
   1. CDNA kodlaması ile, ICAM-1'in ektodomainini, C-terminal ucunda bir His6 etiketi ile eklenmiş bir rekombinant protein üretmek için indüklenebilir bir metallotiyonin promotörü ile Drosophila ekspresyon vektörü pMT/V5-His'e klonlayın.
   2. Elde edilen ICAM-1 içeren plazmit ve bir genetik (G418) ekspresyon vektörü ile S2 hücrelerini birlikte transfekte edin. 3 hafta boyunca% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve 0.5 mg / mL G418 ile desteklenmiş Schneider'in Drosophila Media'sını kullanarak stabil transfektanları seçin. Hücreleri serumsuz böcek ortamında genişletin ve 3 gün boyunca 0.5 mM CuS04 ile bir protein ekspresyonunu indükleyin.
   3. Kültür süpernatantı 10x'i konsantre edin ve daha önce tarif edildiği gibi teğetsel bir akış yoğunlaştırıcı aracılığıyla PBS'ye karşı diyalize edin.
   4. Konsantre kültür süpernatanı, kovalent olarak immobilize edilmiş bir anti-ICAM-1 monoklonal antikoru ile Sefaroz içeren bir kolona uygulayın ve bağlı ICAM-1'i 50 mM glisin tamponu, pH 3.0 ile elüte edin. Ayrıştırılmış ICAM-1 proteinini 2 M Tris tamponu, pH 8.0 ile hemen nötralize edin.
   5. Ayrıştırılan materyali PBS, pH 8.0'a karşı diyalize edin ve diyaliz materyalini Ni-NTA (Nikel-Nitriloasetik asit) agaroz içeren bir kolona ekleyin. 200 mM imidazol, pH 8.0 ile çözünür ICAM-1'i elute. Ayrıştırılan materyali bir PBS tamponu, pH 8.0'a karşı diyalize edin.
   6. Saflaştırılmış ICAM-1'i Siyanin5 N-Hidroksisüksinamid (Cy5 NHS) ester ile üreticinin talimatlarına göre etiketleyin.
      not: En iyi nihai boya-protein oranı 1:1'dir.
5. Papain sindirimi ile bir anti-CD107a antikorundan Fab fragmanları üretin ve Fab fragmanlarını daha önce tarif edildiği gibi iyon değişim kromatografisi ile saflaştırın. Fab parçalarını üreticinin talimatlarına göre Alexa Fluor 568 NHS ester ile etiketleyin.

3. Cam Destekli Düzlemsel Lipid Çift Tabakalarının Oluşumu

1. 140 mL konsantre sülfürik asit ve 60 mL% 30 hidrojen peroksit karıştırarak taze asidik bir piranha çözeltisi hazırlayın. Akış slaytları için cam lamelleri asitli pirana solüsyonunda 30 dakika bekleterek yıkayın. Cam lameli polipropilen makas tipi forseps ile tutun.
   Dikkat: Piranha çözeltisi son derece güçlü bir oksitleyicidir. Solüsyonu tutarken her zaman koruyucu gözlük veya koruyucu gözlük veya kalın lastik eldivenlerle birlikte tam yüz siperi takmayı unutmayın. Piranha çözeltisi ile sadece çeker ocak altında çalışın. Patlayabileceğinden, kullanım sırasında herhangi bir zamanda ısıtmaktan, taşımaktan veya sallamaktan kaçının. Piranha atıklarını kurşun içeren bir deliği olan bir cam şişeye toplayın. Uygun atık kullanımı hakkında Kurumsal Güvenlik Komitesi ile iletişime geçin.
2. Yıkanmış lamelleri 7x ultra saf su ile durulayın, sırayla tatlı su içeren beherlere aktarın. Kalan suyun temiz camdan akmasına izin vermek için ıslak lamelleri bir kenara koyun ve kuru camı geride bırakın.
   1. Alternatif olarak, lamellerden kalan su damlacıklarını dikkatlice çıkarmak için bir vakum pompasına bağlı bir pipet ucu kullanın.
3. Steril başlıkta, iki tabaka yapmak için lipozom karışımını üretmek için çeşitli lipitlerin seyreltmelerini gerçekleştirin. İlk olarak, 37 μL DOPC lipozomlarını ve 3 μL Biotinyl-Cap-PE lipozomlarını birleştirin. İkinci olarak, 14 μL DOPC lipozomlarını ve 15 μL DOGS-NTA lipozomlarını karıştırın. Üçüncüsü, son lipozom karışımını oluşturmak için ilk karışımın 1 μL'sini ikinci karışımın 29 μL'sine ekleyin.
4. Steril davlumbazda, yanınızda kuru lameller bulunan bir çalışma alanı kurun. Son lipozom karışımının 2 μL'sini (bkz. adım 3.3) tam olarak kendinden yapışkanlı bir slayt kanalının merkezinde alikot edin. Temiz ve kuru bir lamel ile hemen ve çok hassas bir şekilde hizalayın ve lamel lamel yumuşak bir şekilde slaydın yapışkan tarafına indirin.
   1. Birden fazla slayt hazırlıyorsanız, lipozom karışımı hızla buharlaştığı için her seferinde bir slayt üzerinde çalışın. Sürgüyü ters çevirin ve lamel ile çevresel temasına hafif bir basınç uygulamak için polipropilen makas tipi forsepslerin dış halkasını kullanın, sızıntıyı önlemek için kaymanın sürgüye sıkıca takıldığından emin olun.
      not: Lamelin kırılmasını veya çatlamasını önlemek için sürgünün kanallarına bastırmayın.
   2. Slaytı tekrar ters çevirin ve lamel ile kanal kızağı arasında bir damla gibi görünen oluşan çift katmanın konumunu, montajın dış sürgü tarafındaki çift katmanın etrafına kalıcı bir işaretleyici ile 4 nokta çizerek işaretleyin.
5. Bir sıvının kanala ilk enjeksiyonundan önce, kanalın bir portunu giriş portu ve diğerini çıkış portu olarak belirleyin ve bu tanımlamayı deney boyunca koruyun.
6. Kabarcık oluşmasını önlemek için, pipet ucunun ucunu doğrudan kanalın giriş portuna sokun. Slaytın kanallarını 50 μL ılık (en az oda sıcaklığında) tahlil tamponu ile yavaşça doldurun (tampon bileşimi için bkz. adım 1.5).
7. 0.5 M nikel(II) klorür çözeltisi hazırlayın. 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosunda 2 mL'lik bir kazein çözeltisi alikotunu çözün ve 200 μM'lik bir nihai konsantrasyonda bir nikel klorür çözeltisi ile destekleyin.
8. Önce kanalın giriş portuna 100 μL kazein solüsyonu enjekte ederek ve ardından pipetleme ile slayt üzerindeki çıkış portundan hemen 100 μL çıkararak çift katmanları yıkayın. Her kanalın giriş portuna 100 μL kazein çözeltisi enjekte ederek ve slaytı oda sıcaklığında 45 dakika inkübe ederek çift katmanları aynı çözelti ile bloke edin.
9. Cy5-ICAM-1-His₆ ve streptavidin proteinlerinin alikotlarını çözün. Tahlil tamponundaki proteinleri, her biri 2 μg / mL'lik nihai konsantrasyonda birleştirin. Herhangi bir agregayı çıkarmak için çözeltiyi 20.000 x g ve 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
10. Pipetleme yoluyla engelleme solüsyonunun geri kalanını slayt kanalının çıkış portundan çıkarın. Giriş portuna ICAM-1 ve streptavidin içeren çözeltiden 100 μL enjekte edin.
11. Slaytı oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Çıkış portundan fazla protein çözeltisini çıkarın. Önce kanalın giriş portuna 100 μL tahlil tamponu enjekte ederek ve ardından çıkış portundan hemen 100 μL çıkararak çift tabakayı 2x'i yıkayın.
12. Alexa-Fluor-488 etiketli bir anti-CD3 antikorunu tahlil tamponu ile 2 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. 100 μL antikor solüsyonunu slaydın giriş portuna enjekte edin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Çıkış portundan fazla protein çözeltisini çıkarın. Çift tabakayı 2x'i adım 3.11'deki gibi 100 μL tahlil tamponu ile yıkayın.

4. T Hücrelerinin Düzlemsel Çift Tabaka ile Etkileşiminin Görüntülenmesi

1. Sıcaklık 37 °C'de dengelenene kadar sahneyi ve konfokal veya toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunun amacını önceden ısıtın. Slaytı, ısıtılmış tabla üzerinde çift katman(lar) ile ayarlayın. Sahneyi mürekkep işaretlerine göre uygun bir konuma getirin ve Cy etiketli ICAM-1 moleküllerinin floresansını kullanan çift katmana odaklanın.
   1. Uygun filtre ayarlarıyla konfokal mikroskop için 61X objektif veya TIRF mikroskobu için 100X objektif kullanın.
2. TIRF mikroskobu ile granül salım görüntüleme için, hücreleri giriş portlarına enjekte etmeden önce Alexa-Fluor-568 etiketli anti-CD107a antikoru Fab fragmanlarını 4 μg / mL'lik bir son konsantrasyonda hücre süspansiyonuna ekleyin.
   1. LN, PB veya kordon kanından izole edilen hazırlanmış CD4 ⁺ T hücrelerini yeniden süspanse edin ve 50 μL hücre süspansiyonunu çift tabakayı içeren slayt kanalının giriş portuna enjekte edin.
3. İstediğiniz alan sayısını seçin ve enjeksiyondan sonra 30 dakika boyunca her 2 dakikada bir 1x olarak her alanın görüntülerini kaydedin.
4. Görüntüleri elde etmek için konfokal mikroskobun parlak alan, yansıyan ışık ve floresan kanallarından (Alexa 488 ve Cy5) yararlanın. TIRF mikroskobunda Alexa-Fluor-488 ve Alexa-Fluor-568 floresan için TIRF modunu ve Cy5 floresan için geniş alanı ve parlak alan görüntülemeyi kullanın.