İmmünomodülatör Farmakolojik Bir Ajanın Dendritik Hücreler ve CD4+ T Hücreleri Arasındaki Etkileşim Üzerine Etkisi

Özet

Kaynak: Wei, H., et al. Murin Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Geliştirilmesi ve Fonksiyonel Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (135), (2018).

Bu videoda, immünomodülatör bir farmakolojik ajan kullanarak dendritik hücreleri (DC'ler) tolerojenik DC'lere (TolDC'ler) dönüştürme yöntemi gösterilmektedir. Bu dönüşüm, CD4 + T hücreleri üzerindeki immünosüpresif etkileri yoluyla TolDC fonksiyonunun değerlendirilmesiyle doğrulanır.

Protokol

1. TolDC'lerin İşlevini In Vitro ve In Vivo Olarak Değerlendirin

1. T hücresi Sinjeneik Proliferasyon Testi
   1. Tüm cerrahi aletleri otoklavlama yoluyla sterilize edin ve deneyi uygun güvenlik prosedürlerine sahip sınıf II biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirin.
   2. 500 ml PBS'de% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA kullanarak MACS tamponunu hazırlayın. 0,2 μm'lik bir filtreden süzerek tamponu sterilize edin.
      not: Bir sonraki deney sırasında tamponu buzun üzerinde tutun.
   3. CD4 + T hücreleri elde etmek için, bir CO₂ odası kullanarak 8-10 haftalık OT-II T hücresi reseptörü (TCR) transgenik farelere ötenazi yapın. Fareyi bir diseksiyon tahtasına yerleştirin ve% 70 etanol ile durulayın. Cerrahi makas ve forseps kullanarak dalağı karnın sol tarafından izole edin.
   4. Dalağı 2 ml PBS ile 6 cm'lik bir kültür kabına koyun ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek dalağı kıymak için 3 ml'lik bir şırınganın itme çubuğunun arkasını kullanın.
   5. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
   6. Hücre peletini 400 μl MACS tamponunda yeniden süspanse edin.
   7. 100 μl CD4+ T Hücresi Biotin-Antikor Kokteyli 4°C'de 5 dakika ekleyin.
      not: Antikor kokteyli, CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC sınıf II, Ter-119 ve TCRγ/δ gibi CD4+ T hücreleri dışındaki diğer hücre tiplerine bağlanır.
   8. 300 μl MACS tamponu ve 200 μl Anti-Biotin boncuk (Malzeme Tablosu) 4°C'de 10 dakika ekleyin.
   9. Ferromanyetik kürelerden (Malzeme Tablosu) ve Ön Ayırma Filtresinden oluşan sütunu manyetik alana yerleştirin ve 3 ml MACS tamponu ile durulayın.
   10. Hücrelere 9 ml MACS tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
   11. Hücre peletini 3 ml MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve kolona uygulayın. CD4 + T hücreleri içeren akışı toplayın.
   12. Sütunu başka bir 3 ml MACS tamponu ile yıkayın ve ayrıca akışı toplayın.
   13. Splenik pan DC'leri elde etmek için, bir CO₂ odası kullanarak 8-10 haftalık C57BL / 6 farelere ötenazi yapın. Fareyi bir diseksiyon tahtasına yerleştirin ve% 70 etanol ile durulayın. Cerrahi makas ve forseps kullanarak dalağı karnın sol tarafından izole edin. Dalağı 2 ml kollajenaz D çözeltisi (kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS içinde çözülmüş 2 mg / ml kollajenaz D) içeren 6 cm'lik bir kültür kabına koyun.
   14. 1 ml kollajenaz D solüsyonunu 1 ml'lik bir şırınga ve 25G'lik bir iğne ile dalağa iki kez enjekte edin. Dalağı küçük bir makasla küçük parçalar halinde kesin.
   15. Çalkalayın ve oda sıcaklığında 25 dakika inkübe edin.
   16. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 μl 0,5 M EDTA ekleyin.
       not: 1.1.13-1.1.14 arasındaki adımlar, DC'lerin verimini artırmak için kritik öneme sahiptir.
   17. Şimdi 3 ml'lik şırınganın itme çubuğunun arkasını kullanarak 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek dalak bulamacını doğrayın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyerek hücre süspansiyonunu toplayın.
   18. Hücre peletini 350 μl MACS tamponu, 50 μl FcR Bloke Edici Reaktif ve 100 μl Pan Dendritik Hücre Biyotin-Antikor Kokteyli içinde 4 ° C'de 10 dakika boyunca yeniden süspanse edin.
       not: DC'ler tarafından eksprese edilmeyen antijenlere karşı antikor kokteyli.
   19. 9 ml MACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   20. Hücre peletini 800 μl MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de 200 μl Anti-Biotin boncukları ekleyin.
   21. DC'leri toplamak için 1.1.9-1.1.11 arasındaki adımları tekrarlayın.
   22. Kolonu 3 ml başka bir MACS tamponu ile iki kez yıkayın ve ayrıca akışı toplayın.
   23. 2 x 10⁵ DC / ml'yi 100-400 nM CDDO-DFPA varlığında veya yokluğunda 37 ° C'de 1 saat boyunca tedavi edin. Ayrı olarak, CD4 + T hücrelerini (1 x 10⁷ / ml) 1 μM CFSE ile 37 ° C'de 15 dakika boyunca etiketleyin, PBS ile yıkayın ve 2 x 10⁶ T hücre / ml'de nihai konsantrasyonu elde etmek için hacmi yeniden ayarlayın.
   24. Daha sonra, 96 oyuklu bir plakada, her ikisi de 1:10 oranını elde etmek için yukarıdaki adımlardan toplanan, aynı hacimde CFSE etiketli CD4 + T hücresi ile muamele edilmiş dendritik hücrelerin 100 μl'sini kokültür edin. Şimdi kuyucuk başına 100 ng / mL ovalbümin (OVA) peptid 323-329 ekleyin ve 2-3 günlük inkübasyondan sonra akış sitometrisi ile T hücrelerinin CFSE yoğunluğunu ölçün.
       not: DC'lerin ve T hücrelerinin hücre sayıları ve oranı önceki çalışmalarımıza göre optimize edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata İlaç	Kurum İçi Sentez	Hücre kültürü
Fare GM-CSF	Peprotech A.Ş.	315-03	BMDC farklılaşması
Pan dendritik hücre izolasyon kiti	Miltenyi Biyotec A.Ş.	130-100-875	T hücresi proliferasyon testi
Pan Dendritik Hücre Biyotin-Antikor Kokteyli	Miltenyi Biyotec A.Ş.	130-100-875	T hücresi proliferasyon testi
CD4+ T hücre izolasyon kiti	Miltenyi Biotec Inc	130-104-454	T hücresi proliferasyon testi
CFSE (Mali İşler T	Biyo Efsane	423801	T hücresi proliferasyon testi
FcR Bloke Edici Reaktif	Miltenyi Biyotec A.Ş.	130-100-875	T hücresi proliferasyon testi
Anti-Biotin Mikro Boncuklar	Miltenyi Biyotec A.Ş.	130-104-454	T hücresi proliferasyon testi
1 ml şırınga	BD Biyolojik Bilimler	309626	T hücresi proliferasyon testi
Bsa	Sigma Aldrich A.Ş	A2058	T hücresi proliferasyon testi
Edta	ThermoFisher Bilimsel	15575020	T hücresi proliferasyon testi
LS Sütunu	Miltenyi Biyotec A.Ş.	130-042-401	T hücresi proliferasyon testi
Ön Ayırma Filtresi	Miltenyi Biotec Inc	130-095-823	T hücresi proliferasyon testi
Kollajenaz D	Sigma Aldrich A.Ş.	11088858001	T hücresi proliferasyon testi
HBSS (Türkçe)	ThermoFisher Bilimsel	14025076	T hücresi proliferasyon testi
Ovalbümin (OVA) peptid 323–329	Sigma Aldrich A.Ş.	O1641	T hücresi proliferasyon testi