Mast Hücrelerinde Salgı Granüllerinin Ekzositozunu Görselleştirmek için İn Vitro Bir Teknik

Özet

Kaynak: Klein, O., et al. FITC-dextran'ın Düzenlenmiş Ekzositoz için Raportör Olarak Görüntülenmesi J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, mast hücrelerinde ekzositozu görselleştirmek için bir tekniği göstermektedir. Hücreler, asidik pH'ın floresansını söndürdüğü salgı granülleri (SG'ler) içindeki hücreler tarafından alınan bir floresan raportör olan FITC-dekstran ile inkübe edilir. Granül ekzositozunun uyarılması üzerine, ortamın daha yüksek pH'ı, bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilen kaynaşmış SG'lerin içinde raportör floresansını indükler.

Protokol

1. Hazırlıklar

1. RBL (RBL-2H3 mast hücre hattı) kültür ortamının hazırlanması
   1. 500 mL düşük glikozlu Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamını (DMEM) 56 mL fetal sığır serumu (FBS), 5.5 mL penisilin-streptomisin-nistatin çözeltisi, 5.5 mL L-Glutamin 200 mM çözeltisi ile karıştırın. Bu, %10 FBS, 100 μg/mL streptomisin, 100 ünite/mL penisilin, 12 ünite/mL nistatin ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş düşük glikoz DMEM ile sonuçlanır.
   2. 0,22 μm gözenek boyutunda bir üst-vakum filtresi kullanarak ortamı filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
2. RBL hücrelerinin bakımı.
   1. RBL hücrelerini 10 cm'lik bir tabakta maksimum% 90'lık bir birleşim noktasına kadar büyütün. Hücre kültürü sağlıklıysa, hücreler ara sıra çıkıntıları olan bir iğ şekline sahip olmalıdır.
   2. Hücre bölünmesi için, ortamı aspire ederek ve 2 mL tripsin / EDTA çözeltisi B ile değiştirerek hücreleri tabaktan ayırın. 37 ° C'de% 5 CO₂ nemlendirilmiş bir atmosferde 5-10 dakika inkübe edin.
   3. Hücreler ayrıldıktan sonra, bir pipet kullanarak 2 mL kültür ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin ve hücreleri 1: 2 - 1: 10 oranında bölün.
3. 20x Tyrode tamponunun hazırlanması
   1. Çift damıtılmış suda (DDW) 54 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 2.74 M NaCl ve 8 mM NaH₂PO_4'ten oluşan 20x stok çözeltisi hazırlayın. İyice karıştırın ve 4 °C'de saklayın.

2. Canlı Hücre Mikroskobu için RBL Hücrelerinin Kültürü

1. FITC-dekstran çözeltisinin hazırlanması.
   1. 1 mL kültür ortamı başına 1 mg floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran tozu (150 K) karıştırın (bkz. adım 1.1.1). Tam odacıklı bir kapak camı için 3 mL hazırlayın.
   2. 0.22 μm gözenek boyutuna sahip bir selüloz asetat şırınga filtre ünitesi kullanarak, çözünmüş FITC-dekstran'ı filtreleyin.
   3. Fare immünoglobulini E'yi (IgE) 1 μg/mL'lik bir konsantrasyona ekleyin.
2. Görüntüleme için RBL hücrelerinin tohumlanması
   1. Görüntülemeden bir gün önce, ortamı kültür kabından aspire edin ve 2 mL tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi B ile değiştirin. 37 ° C'de% 5 CO₂ nemlendirilmiş bir atmosferde 5-10 dakika inkübe edin. Hücreler ayrıldıktan sonra, 2 mL kültür ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.
   2. Bir hemositometre kullanarak RBL hücrelerini sayın ve 7.5 x 10⁵ / mL'lik bir hücre konsantrasyonu elde etmek için hacmi kültür ortamına göre ayarlayın.
   3. Taze FITC-dekstran takviyeli kültür ortamı ile önceden doldurulmuş odacıklı bir kapak camına 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin (bu, bir odada 7.5 x 10³ hücrenin tohumlanmasına neden olur).
   4. RBL hücrelerini gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde büyütün. Hücrelerin ayrıldığından ve her bir hücreyi mikroskop altında ayrı ayrı tanımlamanın kolay olduğundan emin olmak için hücreler alt birleşim seviyesinde kalmalıdır.
3. RBL hücrelerinin transfeksiyonu - isteğe bağlı.
   1. Diğer floresan etiketli proteinlerle kombinasyon halinde ekzositik olayları görüntülemek için, Azouz ve ark.'daki RBL hücreleri için transfeksiyon protokolüne bakınız.

3. Ekzositozun Canlı Hücre Mikroskobu

1. Çözeltilerin hazırlanması:
   1. Stok çözeltisini DDW içinde 1:20 seyreltme ile seyrelterek ve 20 mM Hepes pH 7, 1.8 mM CaCl₂, 1 mg / mL sığır serum albümini (BSA) ve 5.6 mM glikoz ile takviye ederek nihai bir Tyrode tampon çözeltisi hazırlayın.
   2. Tyrode'un tamponunda 20x sekretagog reaktifini taze hazırlayın [bizim durumumuzda insan serum albüminine (DNP-HAS (Ag)) konjuge edilmiş 1 μg / mL dinitrofenil, 50 ng / mL 1x konsantrasyon için].
   3. Tozu Tyrode'un tamponunda çözerek 400 mM'lik bir amonyum klorür çözeltisi hazırlayın.
2. Hücrelerin hazırlanması.
   1. Hazneli kapak camını, ortamı hazneden aspire ederek ve önceden 37 °C'ye ısıtılmış 300 μL Tyrode tamponu ile yeniden doldurarak 3 kez yıkayın. Son olarak, hazneyi önceden 37 °C'ye ısıtılmış 300 μL Tyrode tamponu ile doldurun.
   2. Odacıklı kapak camını mikroskobun inkübatör odasına yerleştirin. Haznenin sağlam olduğundan emin olun.
3. Mikroskobun kurulması
   1. İzlenecek bir ilgi alanı seçmek için, floresan ışık kaynağını (geleneksel olarak bir cıva lambası) açın ve uygun floresan filtresini seçin (FITC-dekstran'i görüntülemek için yeşil floroforlar için filtreyi seçin). İlgilenilen bölge netlendiğinde ve görüş alanının ortasına geldiğinde, foto-ağartma ve toksisiteyi önlemek için ışık kaynağını kapatın.
      NOT: Hücrelere dahil edilen FITC-dekstran'ın bir kısmı floresanı koruyabilir. Bunun nedeni, FITC-dekstran'ın endozomlar gibi lizozomal olmayan bölmelere de ayrılabilmesidir.
   2. FITC uyarımı için uygun aydınlatmayı açın. Lazer tabanlı bir mikroskop kullanıyorsanız, 488 nm lazeri açın. Emisyon 500 - 550 nm civarında toplanmalıdır (FITC emisyonu 510 - 520 nm'de zirve yapar).
   3. Konfokal mikroskop kullanırken, iğne deliğini maksimuma kadar açın. Bu, ağartma ve toksisiteyi önlemek için daha düşük lazer gücünün kullanılmasına izin verecek ve hücrenin tüm düzlemlerinden ekzositoz olaylarının yakalanmasını sağlayacaktır.
   4. Görüntü alımları arasındaki zaman aralığını kalibre edin.
      1. Farklı hücreler, düzenlenmiş ekzositoz kinetiğinde farklılık gösterebilir. Bileşik ekzositozun spesifik görüntülenmesi için en az 5 saniyelik bir zaman aralığı öneriyoruz. Bununla birlikte, genel bir kural olarak, hızlı görüntülemeye izin vermek için, tek bir karenin çekim süresinin hızlı olduğundan emin olun.
      2. Lazer taramalı konfokal mikroskop kullanırken, tarama yönünü iki yönlü olarak ayarlayın, ortalamaya izin vermeyin ve çözünürlüğü 512 x 512 olarak ayarlayın (önerilir; son iki hüküm de ağartma ve toksisiteyi en aza indirmeye yardımcı olacaktır).
4. Ekzositozun görüntülenmesi.
   1. Hücre veya sekretagog tipine bağlı olarak istenen süreler için hücreleri görüntüleyin. IgE / Ag ile tetiklenen RBL hücrelerinde, çoğu ekzositik olay aktivasyondan 15-20 dakika sonra meydana gelir.
   2. Hücrelerin aktivasyonu için, 20x sekretagog çözeltisinden odaya 16 μL ekleyin.
5. Hücrelerde FITC-dekstran varlığının doğrulanması.
   1. FITC-dekstran'ın SG'lere varlığını ve lokalizasyonunu doğrulamak için, odaya yavaşça 16 μL amonyum klorür çözeltisi ekleyin (odağı kaybetmemek için odayı hareket ettirmemeye dikkat edin) (bu, 20 mM'lik bir nihai konsantrasyon yapacaktır). Bu, SG'lerin alkalizasyonuna ve saniyeler içinde gerçekleşecek olan FITC floresansının dequenlenmesine neden olacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM düşük glikoz	Biyolojik İndükleyiciler	01-050-1A
Fetal sığır serumu	Gibco (Gibco)	12657
Kalem-strep-nistatin çözeltisi	Biyolojik İndükleyiciler	03-032-1B
L-Glutamin 200 mM çözeltisi	Biyolojik İndükleyiciler	03-020-1A
FITC dekstran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Tripsin / EDTA Çözeltisi B	Biyolojik İndükleyiciler	03-052-1A	Kullanmadan önce 37 °C su banyosunda ısıtın
0,22 μm gözenek boyutuna sahip üstten vakumlu filtre	Sigma-Aldrich	CLS430769-1 EA
Selüloz asetat şırınga filtre ünitesi, 0,22 μm gözenek boyutu	Sartorius	16534 Bin
Odacıklı kapak camı	Termo bilimsel	155411
Corning doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kapları	Sigma-Aldrich	CLS430167
Sığır serum albümini	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoklonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçının
Hepes tamponu 1M, pH 7.4	Biyolojik İndükleyiciler	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
glikoz	BDH Laboratuvarları	284515V
Amonyum klorür	MERK	1145
BORULAR dipotasyum tuzu	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Kalsiyum asetat hidrat	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnezyum asetat tetrahidrat	Sigma-Aldrich	M5661
Potasyum glutamat (L-Glutamik asit, potasyum tuzu monohidrat)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl (Doğal)	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
Kartal	MERK	104936
Elektroporatör	BTX (Türkçe)	ECM830
Konfokal mikroskop, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Eksenel 200M	Şekil 3'te kullanılmıştır. Elektronik sıcaklık kontrollü ile donatılmıştır
Airstream İnkübatör
Konfokal mikroskop, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Gözlemci.Z1 /7	Şekil 2'de kullanılmıştır. Elektronik sıcaklık kontrollü bir GaAsP dedektörü ile donatılmıştır
Airstream İnkübatör
Konfokal mikroskop, Leica	Leica Belediyesi	SP5 (İngilizce	Şekil 1'de kullanılır. Bir leica HyD dedektörü ve bir üst düzey inkübatör (okolab) ile donatılmıştır
RBL-2H3 hücreleri			RBL-2H3 hücreleri, Reuben P. Siraganian laboratuvarında klonlandı. Referans 67'ye bakın

Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi sayılı Kanun Hükmünde Kararname Serisi )