$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Protein Antijeninin PEGile Lipide Konjugasyonu
- 250 mL'lik bir vakum şişesine 1.500–30.000 Dalton (Da) fraksiyonlama aralığına sahip 3 g çapraz bağlı dekstran jel boncuk ekleyin. 60 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve manyetik bir karıştırma çubuğu ile sürekli karıştırın. Şişeyi kapatın ve en az 1 saat boyunca bir karıştırma plakası üzerinde gazdan arındırmayı başlatmak için bir vakuma takın.
- Devir durdurucu kapalıyken 1,0 cm x 30 cm'lik bir cam kromatografi kolonunda, yıkamak için kolona PBS ekleyin. Devir durdurucuyu açın ve sütunu boşaltın. Yıkadıktan sonra, gazdan arındırılmış boncukların bulamacını sütuna ekleyin. Sütun yaklaşık 24 cm'lik bir boncuk yüksekliğine kadar paketlenene kadar bulamacı sürekli olarak ekleyin.
- Sütun, paketlenmiş boncukların üzerinde yaklaşık 4-5 cm PBS'lik bir 'kafaya' sahip olduğunda, aşağıdaki adımları hazırlayın.
- Kolonun üst kısmından 1-2 fit yukarıda bir rafa ulaşacak kadar uzun bir boru parçasını ölçerek bir yerçekimi akış sifonu oluşturun ve kolonun altına yakın bir yere düşen ve kolonun tepesine geri dönen bir döngü oluşturun. Borunun bir ucuna, borunun bir tarafını açık bırakarak bir devir durdurucu ekleyin. Açık tüp ucunu 500 mL'lik bir PBS şişesine yerleştirin ve sütunun üzerindeki rafa yerleştirin.
- Devir durdurucu ile ucunu alın ve 10 mL'lik bir şırınga takın. Boru hattındaki devir durdurma vanasını açın ve PBS'yi borudan çekin. PBS, boru boyunca yolun dörtte üçüne ulaştığında, şırıngayı hızlı bir şekilde çıkarın ve devir durdurucuyu kolonun üstüne ekleyin - sıvı kolona akıyor olmalıdır.
NOT: Kolonun üst kısmında kalan PBS'nin 'baş' miktarı 1 ile 3 cm arasında olmalıdır. Sütunu yıkamak için minimum miktar 3 sütun hacmidir.
- Moleküler ağırlığına (MW) göre lipitlere bağlanacak protein (mol) miktarını belirleyin.
NOT: Keçi anti-fare immünoglobulininin Fab fragmanı, IgM (kendisi bir IgG) burada B hücrelerinin poliklonal stimülasyonu için evrensel bir vekil antijen olarak kullanılır. Buna göre, keçi IgG'nin Fab fragmanı yaklaşık 48 kiloDalton (kDa) MW'ye sahiptir ve toplam 1.3 mg miktarında ticari olarak temin edilebilir. Böylece bağlanacak protein miktarı 27.1 μmol'dür.
- İlgilenilen proteinin yok olma katsayısını belirleyin. Bilinmiyorsa, bir spektrofotometre kullanarak 280 nm'de protein absorbansını ölçün ve A280 değerini adım 1.4.
'de hesaplanan mol sayısına bölün
NOT: Fab of keçi IgG'nin 280 nm'deki yok olma katsayısı 64.600 M-1'dir.
- Eser miktarda amin içeren tamponun çıkarıldığından emin olmak için, 1.1-1.3 adımlarında oluşturulan kolon üzerindeki proteini tuzdan arındırın ve protein fraksiyonlarını 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (fraksiyon başına ~ 500 μL) toplayın.
- Kolonun üst kısmına bağlı devir durdurma vanasını kapatın ve kolonun üst kısmını çıkarın. Henüz açık değilse, kolonun altındaki devir durdurma vanasını açın ve PBS'nin 'kafası' boncukların tepesine çarpana kadar bekleyin.
- Boncukların üst kısmındaki rahatsızlığı en aza indirmeye dikkat ederek, bir cam Pasteur pipeti kullanarak ilgilendiğiniz proteini boncukların üst kısmına yavaşça ekleyin.
- Protein çözeltisinin 'başı' boncukların tepesine ulaştığında, bir Pasteur pipeti ile nazikçe 1 mL PBS ekleyin. Üç kez tekrarlayın. 4-5 cm'lik bir kafa oluşturmak için PBS ekleyin ve sütunu yıkamak için adım 1.3'ü tekrarlayın.
NOT: Amin içeren tampon bulunmadığından eminse bu adım atlanabilir.
- A280 değerlerini ölçerek protein içeren fraksiyonları belirleyin ve proteinin yaklaşık% 90 geri kazanımını sağlayan fraksiyonları bir araya getirin.
NOT: Bu tipik olarak proteini 1.5-2 kat seyreltir. Havuzlamadan sonra protein konsantrasyonunu belirleyin. Gerekirse, bir santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak proteini bu adımda konsantre edin.
- Proteine heterobifonksiyonel çapraz bağlayıcının 2.5 molar eşdeğerini ekleyin.
- İlk olarak, bir mikrosantrifüj tüpüne yaklaşık 5 mg süksinimidil 3- (2-piridilditio) propiyonat (SPDP, MW = 314 g / mol) tartın. SPDP'yi çözecek hacmi belirlemek için, molar protein konsantrasyonunu dörtlüp edin ve250x, reaksiyonda 2.5 molar fazlalık verecek 100x'lik bir çözelti oluşturmak için.
NOT: Örneğin, protein konsantrasyonu 50 μM ise, 12.5 mM'de bir SPDP çözeltisine ihtiyaç vardır. 5 mg SPDP için bu, 1.27 mL dimetil sülfoksite (DMSO) karşılık gelir.
- 1:100 seyreltmede ilgilenilen proteine SPDP ekleyin. Reaksiyonu yaklaşık 1 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) salınımlı bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
- Fazla SPDP'yi çıkarmak ve sonraki indirgeme adımında proteindeki endojen disülfür bağlarını korumak için, pH 5.5'te 100 mM sodyum asetatta (NaOAc) 1.1-1.3 adımlarında oluşturulan sütunu dengeleyin ve yıkayın veya yalnızca bu tamponda kullanım için özdeş bir sütun oluşturun.
- SPDP ile 1 saat inkübasyondan sonra, 100 mM NaOAc içinde dengelenmiş kolon üzerindeki proteini tuzdan arındırın. Eluent olarak 1.6 mM NaOAc (pH 100) kullanmak dışında, bu adımı 5.5. adım ile aynı şekilde gerçekleştirin. Kesirleri toplayın, A280'i belirleyin ve en üst kesirleri birleştirin. Sütunu PBS'de yıkayın.
- Çift damıtılmış suda (ddH2O) 2,5 M DTT (MW = 154 g/mol) çözeltisi hazırlayın. Havuzlanmış protein fraksiyonlarına 5-10 dakika boyunca 25 mM DTT ekleyin.
- Proteinin A280'ini ölçün ve bunu yok olma katsayısına bölün. Ayrıca, A343'ü belirleyin. Protein (A280) ve bağlayıcının (A343) molaritesine dayalı olarak bağlanma oranını hesaplayın.
NOT: Nanodrop spektrofotometre kullanıyorsanız A340 otomatik kalibrasyonunu kapatın. A343 ölçümü, DTT tarafından SPDP çapraz bağlayıcısından çıkarılan piridin 2-tiyon grubunun (yok olma katsayısı = 7550 M-1) absorbansını temsil eder. Bağlayıcının molar oranı: 1.2-1.5'lik protein oranı, geniş bir protein yelpazesinde 2.5 molar fazla SDPD ile reaksiyon gerçekleştirilirken genellikle elde edilir.
- Havuzlanmış kesirleri yukarıda açıklandığı gibi PBS'de yıkanan sütun üzerinde çalıştırın. Kesirleri toplayın, A280'i belirleyin ve havuz üstü kesirlerini belirleyin. Fraksiyonları bir araya getirdikten sonra protein konsantrasyonunu A280 ile belirleyin.
- DSPE-PEG (2000) -Maleimid (1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N- [metoksi (polietilen glikol) -2000) -Maleimid hazırlayın. Bu, proteine 10:1 molar oranında eklenecektir. İstenilen konsantrasyonu elde etmek için 100x DSPE-PEG (2000) -Maleimid stoğu hazırlayın.
- Örneğin, adım 1.14'ten sonra protein konsantrasyonu 10 μM ise, 10 mM'de bir DSPE-PEG (2000) -Maleimid stoğu hazırlayın. DSPE-PEG (2000) -Maleimid (MW = 3000 g / mol) dikkatlice tartın ve uygun miktarda DMSO ekleyin. Birden fazla nazik girdap ve sonikasyon turu tamamen çözülmesine neden olabilir.
- Adım 1.14'teki fraksiyonların toplam hacmini belirleyin ve çözeltiyi dikkatlice küçük (10-25 mL) yuvarlak tabanlı bir şişeye (RBF) aktarın. 1x, 10 kat molar fazlalık, nihai konsantrasyon elde etmek için proteine uygun miktarda 100x DSPE-PEG (2000) -Maleimide ekleyin. DMSO'nun tamamen dağıldığından emin olmak için çözeltiyi hafifçe döndürün.
- Reaksiyonu gece boyunca kapalı bir RBF'de nitrojen altında çalıştırın. Kauçuk bir septum kullanın ve çeker ocak içine yerleştirin.
Bir - vakuma bağlı borunun ucundaki 3 mL'lik bir şırıngaya bağlı 20 G'lik bir iğne ile septumu delerek atmosferi çıkarın ve vakumu 3-5 saniye boyunca açın.
- Atmosferi azotla değiştirin. 3 mL'lik bir şırıngaya bağlı bir balonu nitrojenle ikiye bölün ve 20 G'lik bir iğne takın. Yuvarlak tabanlı şişenin içindeki atmosferi nitrojenle doldurmak için septumu delin. Atmosferin uzaklaştırılmasını ve nitrojen ile değiştirilmesini bir kez daha tekrarlayın ve nitrojen balonunu gece boyunca takılı bırakın.
- 1.0 cm x 50 cm'lik bir cam kromatografi kolonunda (1.1-1.3 adımlarına göre) 4.000-150.000 Da fraksiyonlama aralığına sahip ayrı bir çapraz bağlı dekstran jel boncuk sütunu hazırlayın.
- Ertesi gün, proteini adım 1.17'de hazırlanan yuvarlak tabanlı şişeden çıkarın ve çapraz bağlı dekstran jel boncuk sütunu (adım 1.18'den itibaren) üzerinden geçirin (adım 1.6'da kullanılan yöntemi izleyin).
NOT: Kolona yüklenecek toplam miktar 2 mL'den fazla olmamalıdır. Daha büyük bir reaksiyon kullanılmışsa, ikiye bölün ve ayrı sütunlarda çalıştırın veya daha büyük çaplı bir sütunda çalıştırın.
- Fraksiyonları toplayın, A280'i belirleyin, havuz üstü fraksiyonlarını belirleyin ve protein konsantrasyonunu belirleyin. Lipidin varlığı ölçümleri etkilemeyecektir.
- Lipid bağlı proteinin son havuzlanmış fraksiyonlarını kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
2. Lipozom Hazırlama
- Lipitleri tartın: DSPE-PEG (2000) (1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi (polietilen glikol) -2000, MW = 2805.5 g / mol; Kolesterol (3b-Hidroksi-5-kolesten, 5-Kolesten-3b-ol), MW = 386.7 g/mol; ve DSPC (1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin), MW = 790.1 g/mol. Kloroformda 5 mg / mL DSPC çözeltisi, 4 mg / mL Kolesterol çözeltisi ve 2 mg / mL DSPE-PEG (2000) çözeltisi oluşturun.
- Lipozomlardaki lipitlerin molar oranının: Tablo 1.
'de gösterildiği gibi:% 57 DSPC,% 38 Kolesterol ve% 5 DSPE-PEG (2000) olduğundan emin olun.
NOT: Genellikle %0.01-0.1 arasında değişen lipozom üzerindeki antijen miktarını kontrol etmek önemlidir. Tablo 1'de, PEGile lipide bağlı keçi anti-fare IgM Fab fragmanının %0.1'i kullanılmıştır. Toplam PEGile lipid miktarının %5'i geçmemesini sağlamak için, adım 1.15'te proteine eklenen DSPE-PEG (2000) -Maleimid'in 10 kat molar fazlalığını hesaba katmak çok önemlidir.
- Ekstrüzyon için lipitler oluştururken nihai lipit miktarlarını (μmol) göz önünde bulundurun. 1.25 μM toplam lipid konsantrasyonunda lipozomların oluşturulması için molar lipid konsantrasyonlarının hesaplanmasına ilişkin bir örnek için Tablo 1'e bakınız.
- Birbirine eklenecek her bir lipitin doğru miktarı hesaplandıktan sonra, hepsini 12 mL'lik bir borosilikat cam test tüpünde birleştirin.
- Kloroformu dikkatlice üfleyin.
- Tüpteki kloroformu nitrojenle dikkatlice üflemek için boruyu ve adım 1.17.1'de hazırlanan iğneli 3 mL'lik bir şırıngayı kullanın. Diğer elinizle tüpü döndürürken çözeltinin üzerine hafifçe bir nitrojen akışı üfleyin. Sıçramayı en aza indirmeye veya sıvının tüpün yanından yukarı akmasına neden olmaya dikkat edin, çünkü bir sonraki adımda bunu çözeltiye sokmak daha zor olabilir.
- Her tüpe 100 μL DMSO ekleyin ve bu çözeltiyi gece boyunca liyofilize edin. Tüpün üstünü statik olmayan bir laboratuvar mendili ile örtün, bir lastik bantla sabitleyin ve -80 °C'de dondurun.
3. Lipozom Ekstrüzyonu
- Lipidlere bağlı proteini içeren 12 mL PBS'yi lipitleri içeren 12 mL'lik tüpe ekleyin. Çözeltiyi bir sonikasyon su banyosunda yaklaşık 30 saniye ila 1 dakika boyunca sonikleştirin. Her tur arasında 5 dakika veya daha uzun süre dinlenin ve 3-4 kez tekrarlayın.
- Üretici tarafından belirtildiği gibi bir ekstrüder hazırlayın.
- Filtre desteklerini iç membran desteğine ekleyin ve parafin film üzerine birkaç damla (her biri 10 μL) PBS yerleştirin. Cımbız kullanarak filtre desteğinin bir kenarını tutun ve 10 μL'lik damlaya batırın.
- Filtreyi O-ringin içine yerleştirin. Bunu her iki taraf için de yapın. Cımbız kullanarak, 10 μL'lik damlanın kenarına daldırılan 0,8 μm'lik bir filtre alın ve O-ringin dışını PBS ile kaplayın. 0.8 μm filtreyi, filtrenin iç membran desteğinden sarkmaması için O-ringin üzerine nazikçe yerleştirin.
- Ekstrüderi önceden ısıtmak için ekstrüder ısıtma bloğunu sıcak bir plakaya yerleştirin. Sıcak plakayı düşük konuma getirin ve ekstrüder ısıtma bloğunun istenen sıcaklığa ulaşmasına izin verin. Protein agregasyonu ile ilgili olası sorunları önlemek için bloğu 37 °C'den fazla ısıtmayın.
- Sonikasyonlu numuneyi, ekstrüdere yerleştirilen ekstrüzyon şırıngalarından birine yükleyin. Ekstrüder şırıngasını ekstrüderin diğer ucuna yerleştirin. Boş şırınga pistonunun sıfıra ayarlandığından emin olun. Lipit, polikarbonat 0.8 μm membrandan ekstrüde edildiğinde boş şırınga dolacaktır. Kabarcıkları zardan ileri geri geçirmekten kaçının.
- Tamamen monte edilmiş ekstrüderi ısıtma bloğuna yerleştirin. Lipitlerle doldurulmuş şırınganın pistonunu yavaşça boş şırıngaya itin. Lipid konsantrasyonuna bağlı olarak, bunun itilmesi zor olacaktır. 20x tekrarlayın.
- Tamamen monte edilmiş ekstrüderi ısıtma bloğundan çıkarın. Doldurulmuş şırıngayı ekstrüderden yavaşça çıkarın, çıkarırken sızabilecek lipitleri topladığınızdan emin olun. Lipozomları temiz bir şişeye yerleştirin. Polikarbonat 0,2 μm ve 0,1 μm membranlar kullanarak 3.4–3.6 adımlarını tekrarlayın.
- PBS'de dengelenmiş, 0,7-10 Mega Dalton (MDa) ayırma aralığına sahip 0,7 x50 cm'lik 2 çapraz bağlı agaroz boncuk sütunu oluşturun. Lipozomları ekleyin ve adım 1.6'daki gibi çalıştırın. Lipozom içeren fraksiyonlar, 250-400 nm aralığında ışık iletimini azaltacaktır.
- Lipozomları 4 °C'de saklayın ve donmayın.
4. Antijenik Lipozomlar Tarafından B Hücresi Aktivasyonunu İzlemek için Kalsiyum Akısı
- Kurumsal standart işletim prosedürlerine göre fareleri karbondioksit (CO2) veya izofluran doz aşımı ile ötenazi yapın. Servikal çıkık ile farelerin ötenazisini onaylayın.
- Cerrahi aletleri ve fare karkasını %70 etanol kullanarak sterilize edin. 10 cm uzunluğunda, 0,8 mm uçlu, kavisli iris forseps kullanarak göğüs boşluğunu kaplayan deriyi göğüs kafesinden ayırın. Bilateral bir kesi ile distal bir kesi yapmak için 10 cm uzunluğunda, düz diseksiyon makası kullanın.
- Dalağı karın boşluğundan çıkarmak için kavisli iris forseps ve diseksiyon makası kullanın. Dalağı çevreleyen yağ dokusunu çıkarın ve ardından %1 fetal buzağı serumu (FCS) ve penisilin-streptomisin içeren RPMI1640 besiyeri ile doldurulmuş 15 mL polistiren konik tüpe yerleştirin.
- Dalak ve ortamı 50 mL'lik bir konik tüp üzerine takılmış 40 μm'lik bir hücre süzgeci üzerinden aktarın. 3 mL'lik bir şırınga pistonunun lastik ucunu kullanarak dalağı hafifçe ezin. 40 μm hücre süzgecini ortamla yıkayın. 40 μm hücre süzgecinde sadece yağ dokusu kalana kadar bu işlemi tekrarlayın. Hücre geri kazanımını artırmak için eleği 3-5 mL ortam ile durulayın.
- Santrifüj hücresi, RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da homojenleştirilir. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve pelete 10 mL 1x RBC lizis tamponu ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyin, RT'de 2-3 dakika bekletin ve ardından RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve kırmızı kan hücresi tükenmiş splenositleri 10 mL ortamda yeniden süspanse edin. Bir hemositometre veya başka bir hücre sayma cihazı kullanarak toplam hücre sayılarını belirleyin. Hücreleri yukarıda tarif edildiği gibi santrifüjleme ile peletleyin.
NOT: Splenositlerin Indo-1 yüklemesi için gerekli ideal nihai konsantrasyon 10–20 x 106 hücre/mL'dir, ancak daha düşük bir hücre konsantrasyonu kullanılabilir.
- Kalsiyum akı yükleme tamponunda (Roswell Park Memorial Institute,% 1 FCS, 10mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 1mM magnezyum klorür (MgCl2), 1mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) -N, N, N', N'-tetraasetik asit (EGTA) ve% 5 penisilin-streptomisin içeren RPMI1640 ortam içinde splenositleri yeniden süspanse edin. 1 mM DMSO stok çözeltisinden 1.5 μM Indo-1 ekleyin ve karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Işıktan koruyun ve hücreleri 37 °C su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
- 30 dakikalık inkübasyonun ardından, kalsiyum akışı yükleme tamponunun 5 katı ekleyin. RT'de 7 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- B hücreleri üzerinde geçit yapmak için, hücreleri 1:200 anti-fare CD5-PE ve anti-fare 1:200 B220-PE/Cy7 ile 0,5 mL yükleme tamponunda 4 ° C'de 20 dakika boyunca ışıktan korunarak boyayın.
- Splenositleri kalsiyum akı yükleme tamponunda yıkayın ve RT'de 7 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Kalsiyum akısı çalışan tamponda 10-20 x 106 hücre / mL'de hücreleri yeniden askıya alın (Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS)% 1 FCS, 1 mM MgCl2 ve 1 mM kalsiyum klorür (CaCl2)). Akış sitometresinde çalışmaya hazır olana kadar ışıktan korunarak buz üzerinde saklayın.
- Kompanzasyon için lekesiz ve tek leke kontrolleriyle akış sitometrisini ayarlayın.
- Kapıları uygun şekilde ayarlamak için lekeli hücreleri çalıştırın (bkz. Şekil 1A). Hint-1 (menekşe) ve Hint-1 (mavi) grafiğini ayarlayın, sinyali en üst düzeye çıkarmak için hücreleri boyamayı 45–60°'lik bir eğime yerleştirmek için Hint-1 kanallarındaki voltajları ayarlayın: Hint-1 menekşe gürültü oranı: B hücresi stimülasyonunu takiben orandaki mavi değişim.
NOT: Voltajların, hücrelerin önemli bir yüzdesi (%>5) grafiğin üst kısmına bakacak şekilde çok yüksek olmadığından emin olun.
- Grafiğin sol üst kısmını (Mor + Mavi-) kapsayan çapraz bir kapı oluşturun, öyle ki stimülasyon olmadan hücrelerin <%10'u kapıda olacak ve bu da stimülasyondan sonra ideal olarak %>75'e çıkmalıdır.
- Kapaklı 5 mL'lik yuvarlak tabanlı polistiren tüpe (floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tüpü) 0,5 mL hücre ekleyin ve hücreleri bir su banyosunda 3-5 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtın. FACS tüpünü, yeniden sirkülasyon yapan bir su banyosuna bağlı 37 °C su ceketli hazneye yerleştirin.
- Tüpü akış sitometresindeki su ceketi içinde çalıştırın ve verileri depolamadan yaklaşık 5.000-10.000 olay/s'de edinimi başlatın. Hücreler stabilize olduktan sonra (15-30 sn), veri toplamaya başlayın ve arka planı oluşturmak için en az 10 saniye boyunca veri toplayın.
- 10 sümük işaretinde, tüpü akış sitometresinden hızlı bir şekilde çıkarın, stimülasyonu (2-20 μL'de 5-50 μM antijenik lipozomlar), nabız girdabını ekleyin ve FACS tüpünü akış sitometresine geri koyun. Bu süre boyunca veri toplama ve depolamayı sürdürün ve 3-5 dakika boyunca veri toplayın.
- Kinetik fonksiyonlar altında uygun analiz yazılımında verileri analiz edin.
Tablo 1: 1.25 μM toplam lipid konsantrasyonlu lipozom oluşturmak için hesaplamalar.Keçi anti-fare IgM F(ab) fragman lipozomları için hesaplama tablosu örneği.
adet
adet
adet
adet
| Mw | 790 | 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC (DSPC) | kolesterol | PEG-DSPE | fazla PEG-DSPE | aIgM-PEG-DSPE | toplam |
| Molar oran | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0,1 | 100,00 |
| Kütle (mg) | 0,56 | 0,18 | 0,14 | 0,04 | 0,06 | 0,98 |
| mmol | 0,71 | 0,47 | 0,05 | 0,01 | 0,00 | 1,25 |
| Ml | 112,50 | 45,93 | 70,64 | 0,00 | 525,97 | 755,03 |
| | | Konsantrasyon (mg/mL) | | | |
| | DSPC (DSPC) | 5 | | | |
| | kolesterol | 4 | | | |
| | PEG-DSPE | 2 | | | |
| | aIgM-PEG-DSPE | 0,114 | | | |
