Bakteri Kültürü Bir Ultrafiltrasyon Cihazı Kullanarak Protein Konsantrasyonunu Süzün.

Özet

Kaynak: Ryan, J. M., et al. Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme. J. Vis. Uzm. (183) (2022)

Bu video, ultrafiltrasyon kullanılarak bakteriyel hücre dışı vezikülleri içeren bakteri kültürü filtrat proteinlerinin izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. Konsantre hücre dışı veziküller, hastalık tespiti için tanısal belirteçler olarak işlev görür.

Protokol

1. Ham Mycobacterium tuberculosis (Mtb) hücre dışı vezikül (EV) konsantresinin hazırlanması

NOT: Mtb yetiştiriciliği ve kültür süzüntü proteininin (CFP) hazırlanması ile ilgili ayrıntılı prosedürler için. Bakteri kültürü ortamının, Oleik Albümin Dekstroz Katalaz (OADC) gibi EV içeren veya proteinli bileşenler içeren büyüme takviyeleri ve Tween gibi deterjanlar içermemesi önerilir. Sınırlı hücre ölümü ve lizizini sağlamak için bakteri kültürünün kalitesinin ve hasat edilen CFP'nin taranması da önerilir.

1. Fosfat tamponlu salinin (100x PBS) tam hacim kapasitesini ekleyerek 1 kDa'lık bir moleküler ağırlık kesme (MWCO) santrifüj filtresi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın). 4 °C'de 2.800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin
   NOT: Ölüdurdurma hacmi olmayan bir filtre kullanıyorsam, numune hacminin filtre seviyesinin altına düşmemesine dikkat edilmelidir, bu da santrifüjleme sırasında filtrenin tamamen kurumasına neden olur.
2. Numune haznesini Mtb CFP ile maksimum kapasitesine kadar doldurmadan önce akışı ve kalan PBS'yi atın. Hacim ultrafiltrasyon cihazının minimum hacmine düşene kadar 4 ° C'de 2.800 x g'da santrifüjleyin. Gerektiği kadar tekrarlayın, tüm numune yeterince azaltılana kadar üniteye daha fazla CFP ekleyin.
   not: İstenirse, aşağı akış kalifikasyonu için 100 kDa akış geçişli (100F) malzemenin bir kısmını saklayın. 4 °C'de saklayın.
3. Konsantreyi içeren filtre ünitesine toplam cihaz kapasitesine kadar 1x PBS ekleyin. Sesi 1.2'de açıklandığı gibi azaltın. Tam yıkama ve tampon değişimini sağlamak için bu adımı beş kez tekrarlayın.
4. 100 kDa konsantre CFP retentatını (100R) ultrafiltrasyon cihazı özelliklerine göre geri kazanın (bkz. Malzeme Tablosu). 100R geri kazanıldıktan sonra, filtreyi en az üç kez minimum 1x PBS hacminde yıkayın ve geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için yıkamayı 100R ile birleştirin.
5. 100R malzemesini, üreticinin talimatlarını izleyerek bir bikinkoninik tahlil (BCA) ile ölçün (bkz. Malzeme Tablosu). Testi gerçekleştirmek için, PBS'de 1:2, 1:5 ve 1:10 numunelerinin birkaç seyreltmesini kullanın. Numuneyi triplicate.
   içinde test edin not: İstenirse, aşağı akış kalifikasyonu için 100R malzemesinin bir kısmını saklayın. 4 °C'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Otomatik Kesir Toplayıcı	IZON Bilim	AFC-V1-ABD Doları
Centricon Plus - 70 Santrifüj filtre, 100 kDa kesme	Kırlangıç Sigma	UFC710008	Adım 1.1'de kullanılan ultrafiltrasyon cihazı
Fosfat tamponlu Salin, 1X kalsiyum ve magnezyum içermez	Corning	21-040-Özgeçmiş
Nitroselüloz membran, Rulo, 0,2 μm	BioRad (BiyoRad	1620112

)