1. Ham Mtb EV konsantresinin hazırlanması
>NOT: Mtb yetiştiriciliği ve kültür filtrat proteininin (CFP) hazırlanması ile ilgili ayrıntılı prosedürler için Referanslara bakınız. Bakteri kültürü ortamının, Oleik Albümin Dekstroz Katalaz (OADC) gibi EV içeren veya proteinli bileşenler içeren büyüme takviyeleri ve Tween gibi deterjanlar içermemesi önerilir. Sınırlı hücre ölümü ve lizizini sağlamak için bakteri kültürünün kalitesinin ve hasat edilen CFP'nin taranması da önerilir.
- Fosfat tamponlu salinin (100x PBS) tam hacim kapasitesini ekleyerek 1 kDa'lık bir moleküler ağırlık kesme (MWCO) santrifüj filtresi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın). 4 °C'de 2.800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin
not: Ölü durdurma hacmi olmayan bir filtre kullanılıyorsa, numune hacminin filtre seviyesinin altına düşmemesine dikkat edilmelidir, bu da santrifüjleme sırasında filtrenin tamamen kurumasına neden olur.
- Numune haznesini Mtb CFP ile maksimum kapasitesine kadar doldurmadan önce akışı ve kalan PBS'yi atın. Hacim ultrafiltrasyon cihazının minimum hacmine düşene kadar 4 ° C'de 2.800 x g'da santrifüjleyin. Gerektiği kadar tekrarlayın, tüm numune yeterince azaltılana kadar üniteye daha fazla CFP ekleyin.
not: İstenirse, aşağı akış kalifikasyonu için 100 kDa akış geçişli (100F) malzemenin bir kısmını saklayın. 4 °C'de saklayın.
- Konsantreyi içeren filtre ünitesine toplam cihaz kapasitesine kadar 1x PBS ekleyin. Sesi 1.2'de açıklandığı gibi azaltın. Tam yıkama ve tampon değişimini sağlamak için bu adımı beş kez tekrarlayın.
- 100 kDa konsantre CFP retentatını (100R) ultrafiltrasyon cihazı özelliklerine göre geri kazanın (bkz. Malzeme Tablosu). 100R geri kazanıldıktan sonra, filtreyi en az üç kez minimum 1x PBS hacminde yıkayın ve geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için yıkamayı 100R ile birleştirin.
- 100R malzemesini, üreticinin talimatlarını izleyerek bir bikinkoninik tahlil (BCA) ile ölçün (bkz. Malzeme Tablosu). Testi gerçekleştirmek için, PBS'de 1:2, 1:5 ve 1:10 numunelerinin birkaç seyreltmesini kullanın. Numuneyi triplicate.
içinde test edin
not: İstenirse, aşağı akış kalifikasyonu için 100R malzemesinin bir kısmını saklayın. 4 °C'de saklayın.
2. Mtb EV'lerin CFP'den zenginleştirilmesi için boyut dışlama kromatografisi
>NOT: Aşağıdaki prosedür, SEC sütunu ve otomatik fraksiyon toplayıcı ile 3 mg 100R Mtb CFP kullanmak için özeldir (AFC, bkz. Malzeme Tablosu). Üreticinin spesifikasyonlarına uyularak diğer başlangıç konsantrasyonları ve kolon tipleri için uyarlanabilir. Ek olarak, kullanıcıların otomatik kesir toplayıcı kullanım kılavuzunu okumaları ve anlamaları önerilir.
- SEC sütununun oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
- Kule ünitesinin arkasındaki güç anahtarını kullanarak AFC'yi açın ve gerekirse ana menü dokunmatik ekranında SETUP düğmesine basarak yük hücresi ayarlarını yapın. Yük hücresi yalnızca ilk kullanımda, her yazılım güncellemesinden sonra ve fraksiyon toplama hacimlerinde tutarsızlık fark edildiğinde kalibre edilmelidir.
- KURULUM ekranından CALIBE > CALIBRATE öğesini seçerek karuseli hizalayın. Karuseli, 13 küçük delik AFC kulesine bakacak şekilde yerleştirin ve - ve/veya + düğmelerine basarak karuseli, sıvı nozulu doğrudan yıkama konumunun üzerinde olacak şekilde ayarlayın.
- Dengelenmiş SEC sütunundan kapakları çıkarın. SEC sütununu uygun sütun montajına kaydırın ve dikkatlice AFC kulesine takın. Kolon üzerindeki radyo frekansı tanımlama (RFID) etiketinin AFC'ye baktığından emin olun ve kolon ile vana arasındaki bağlantının sağlam olduğunu kontrol edin. Atık çıkış borusunu bir toplama kabına yerleştirin.
- KURULUM ekranından Toplama Programını seçin ve - ve/veya + düğmelerine basarak sayımı 13 ve boyutu 0,5 mL olarak ayarlayın. "Buffer Volume" ayarını varsayılan 2,7 mL olarak bırakın ve ardından X'e basarak "Collection Schedule" (Toplama Programı) penceresini kapatın.
- Ana ekrandan TOPLAMAYI BAŞLAT'ı seçin ve EVET'i seçerek toplama parametrelerini onaylayın. 13 etiketli 1.7 mL mikrosantrifüj tüpünü, kapakları açık ve atlıkarınca merkezine bakacak şekilde yükleyin.
- OK'u seçerek AFC'yi ilerletin, ardından sütun rezervuarını monte edin ve OK'a basarak tekrar ilerleyin. EVET tuşuna basarak sütunu boşaltma seçeneğini belirleyin ve herhangi bir depolama arabelleğini çıkarmak için 0,2 μm filtrelenmiş PBS'lik bir sütun hacmi ekleyin. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, OK düğmesine basarak AFC'yi ilerletin.
- Dönen kapağı AFC'nin üzerine yerleştirin ve Tamam'a basın. 0,2 μm filtrelenmiş PBS'lik bir sütun hacmi hazırlayın. Kolondaki fazla arabelleği çıkarmak için bir pipet kullanın.
- 1x PBS ile adım 1.5 ila 500 μL'de ölçüldüğü gibi 3 mg 100R numunesi getirin. 3 mg numuneyi sütunun üstüne ekleyin. AFC'yi ilerletin ve numunenin fritin içine akmasına izin verin. Numune sütuna tam olarak girdikten sonra, adım 2.6'da hazırlanan PBS'yi rezervuara ekleyin.
- Önce boş hacmi ve ardından belirtilen kesirleri toplarken AFC'nin çalışmasını izleyin. Çalışma tamamlandıktan ve atlıkarınca atık konumuna döndükten sonra, kapağı çıkarın ve fraksiyon tüplerini atlıkarıncadan çıkarın. Fraksiyonları, miktar tayini (adım 3) ve kalifikasyondan (adım 4) önce 4 °C'de saklayın.
- Sütun yeniden kullanılacaksa, EVET tuşuna basarak sütunu temizleme seçeneğini belirleyin; aksi takdirde HAYIR'a basın. AFC.
adresindeki talimatları izleyin.
NOT: Kolon yıkandıktan ve depolama tamponu geçtikten sonra çıkarılabilir, kapatılabilir ve 4 °C'de saklanabilir.