1. Aspergillus sporlarının enjeksiyon için hazırlanması
- Bir Aspergillus spor süspansiyonundan, 1 x 106 spor elde etmek için gereken hacmi hesaplayın. Hacim 20–100 μL olmalıdır; değilse,% 0.01 (h / h) steril Tween-20'de (Tween-su; Malzeme Tablosu). Örneğin, hesaplanan hacim 5 μL ise, 10x seyreltme üretin ve 50 μL seyreltilmiş çözelti kullanın.
not: Daha fazla spor toplamak için veya kontaminasyon durumunda yedek olarak iki plaka/suş hazırlanabilir.
- 1 x 106 Aspergillus sporunu, bir biyogüvenlik kabininde steril tek kullanımlık L şeklinde bir yayıcı ile bir glikoz minimal ortam (GMM) plakasına (Malzeme Tablosu) yayın. Plakanın kenarına yayılmaktan kaçının. 37 ° C'de, plaka ters bakacak şekilde 3-4 gün inkübe edin.
- Toplama gününde, steril miracloth ve 50 mL konik tüpler (suş başına iki adet), taze steril Tween-water şişeleri (suş başına bir tane) ve steril tek kullanımlık L şekilli yayıcıları biyogüvenlik kabinine getirin.
not: Miracloth parçalar halinde ~ 8 inç x 6 parçalar halinde kesilebilir, folyoya sarılabilir ve sterilize etmek için otoklavlanabilir.
- Her etiketli 50 mL konik tüpe bir parça miracloth yerleştirin ve yeniden kapatın. Kalan miracloth paketini kaputtan çıkarın.
- Plakaları biyogüvenlik kabinine getirin. Bir tabak açın, ardından plakanın yaklaşık dörtte üçünü kaplayacak şekilde üstüne ara su dökün.
- Tek kullanımlık L şeklinde bir yayıcı kullanarak, mantar kültürünün yüzeyini ileri geri hareketlerle nazikçe kazıyın, diğer elinizle plakayı döndürmek için kullanın. Sporların neredeyse tamamı Tween suyuna homojen hale gelene kadar kazıyın.
not: Yüksek hidrofobiklik nedeniyle, sporlar Tween suyu eklendiğinde veya kazıma sırasında "puflar" oluşturabilir. Yakındaki tüplerin veya plakaların kirlenmesini önlemek için büyük özen gösterilmelidir. Farklı suşların ekstraksiyonu arasında eldivenlerin değiştirilmesi ve yüzeyin% 70 etanol ile silinmesi tavsiye edilir.
- 50 mL'lik bir konik tüp alın ve miracloth parçasını çıkarın. İkiye katlayın ve 50 mL konik tüpün üstüne yerleştirilmiş bir filtre haline getirin.
- Mantar homojenatını plakadan miracloth'un üzerine tüpe dökün.
not: Bir suştan iki plaka hazırlanırsa, her iki plakayı da kazıyın ve aynı konik tüpe dökün.
- Konik tüpteki toplam hacmi 50 mL'ye getirmek için Tween suyunu dökün.
- 10 dakika boyunca 900 x g'da döndürün. Santrifüjde aerosolizasyonu önleyen kapaklar kullandığınızdan emin olun.
- Dekontamine etmek için süpernatanı ~% 10 çamaşır suyu çözeltisine dökün. Konik tüpe 50 mL steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) dökün, ardından peleti yeniden süspanse etmek için girdap yapın veya çalkalayın.
- 10 dakika boyunca 900 x g'da tekrar döndürün. Süpernatanı dökün ve peleti 5 mL steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Taze bir miracloth parçasından 50 mL'lik taze bir konik tüpe süzün.
- 1.7 mL santrifüj tüplerinde mantar homojenatının 10 kat seri seyreltmesini (10x, 100x, 1000x) yapın (örneğin, 10x çözelti için 100 μL mantar homojenatını 900 μL Tween-su ile karıştırın).
- Ara suya boşaltıldığında sporların görünmediği ilk seyreltmeyi seçin ve bu seyreltmeyi bir hemositometre kullanarak spor sayısını saymak için kullanın.
- Aşağıdaki formülü kullanarak hazırlanan mantar homojenatındaki (su süspansiyonu) spor konsantrasyonunu hesaplayın:
Konsantrasyon (sporlar/mL) = Ortadaki 25 kutudaki spor sayısı x seyreltme faktörü x 104
- 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde steril 1x PBS'de 1.5 x 108 spor / mL'lik 1 mL stok hazırlayın. Bu spor preparatı 4 °C'de ~ 4 hafta saklanabilir.
- Enjeksiyonlarda kullanmadan önce, 1 x 108 spor / mL'lik bir nihai spor konsantrasyonu elde etmek için 20 μL spor preparatını 1.7 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 μL% 1 steril fenol kırmızısı ile karıştırın. Enjeksiyondan önce iyice girdap yapın.
NOT:% 1 fenol kırmızısı çözeltisi filtreyle sterilize edilmeli ve alikotlarda saklanmalıdır.
- Sahte bir enjeksiyon için, 20 μL 1x PBS'yi 10 μL% 1 steril fenol kırmızısı ile karıştırın.
2. Enjeksiyon için agar plakalarının hazırlanması
- E3 ortamında% 2 agaroz hazırlayın ve bir mikrodalgada eritin.
- 100 mm x 15 mm'lik bir Petri kabına (plaka başına ~ 25 mL) dökün, plakayı eşit şekilde kaplayacak şekilde döndürün ve soğumaya bırakın.
- Plakayı parafin film ile sarın ve ters çevrilmiş olarak 4 °C'de saklayın.
- Enjeksiyondan önce plakayı oda sıcaklığına (RT) getirin.
- Plakaya ~ 1 mL filtre ile sterilize edilmiş% 2 sığır serum albümini (BSA) dökün, tüm tabanı yaymak ve kaplamak için plakayı eğin ve E3.
ile durulayın
NOT:% 2 BSA çözeltisi filtre ile sterilize edilebilir ve -20 ° C'de 1 mL alikotlar halinde saklanabilir. % 2 BSA ön işlemi, larvaların agarozun yüzeyine yapışmasını önler.
- Tamponlu trikain ile E3'ü plakaya dökün ve enjeksiyona kadar bekletin.
3. Zebra balığı larva arka beyin ventrikül mikroenjeksiyonu
- Bir Petri kabında larvaları forseps ile 2 dpf'de manuel olarak dekoryonlayın.
not: Dekoryonasyon 1.5 dpf'den enjeksiyon zamanına kadar herhangi bir zamanda yapılabilir.
- Petri kabından mümkün olduğunca fazla E3 çıkarın ve larvaları uyuşturmak için E3'te tamponlu 300 μg / mL tricain ekleyin.
not: E3 içinde tamponlanmış 4 mg / mL trikain stok çözeltisi hazırlanabilir ve 4 ° C'de saklanabilir. Çalışma çözeltisi, 4 mL stok çözeltisinin E3 ile 50 mL'ye kadar seyreltilmesiyle yapılabilir.
- Basınç enjektörü, geri basınç ünitesi, ayak pedalı, mikropipet tutucu, mikromanipülatör ve manyetik stand ve plaka ile birlikte verilen ve tümü bir basınçlı hava kaynağına bağlı bir mikroenjeksiyon kurulumu kullanın (Malzeme Tablosu).
- Basınçlı hava valfini açın ve mikro enjektörü açın. Basıncı ~ 25 PSI'ye, darbe süresini 60 ms'ye ve geri basınç birimini inç kare başına 1 Pound'a (PSI) ayarlayın.
- Yaklaşık 3-5 μL hazırlanmış PBS veya fenol kırmızısı ile spor süspansiyonu içeren bir mikro yükleyici pipet ucu (Malzeme Tablosu) kullanarak bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. İğneyi mikromanipülatöre monte edin.
not: Mikroenjeksiyon iğneleri daha önce anlatıldığı gibi hazırlanabilir. Mikroenjeksiyonlar için kullanılan stereo mikroskop, mikroenjeksiyon iğnesini kalibre etmek için bir mercek retikülüne sahip olmalıdır. Retikül bir aşama mikrometresi ile kalibre edilmeli ve retikül ölçeğinin uzunluğu (μm) belirlenmelidir. İğneden çıkan spor süspansiyon damlasının çapı, damla ile örtüşen hash sayısına (retikülün) bağlı olarak ölçülür.
- Mikromanipülatörü, iğnenin ucu stereo mikroskop altında en düşük büyütme oranında görünecek şekilde konumlandırın. İğneyi görüş alanında tutarak 4x büyütmeye yakınlaştırın.
- Keskin forseps kullanarak iğnenin ucunu klipsleyin. Çıkan damlacığın boyutunu görselleştirmek için enjeksiyon pedalına basın. ~ 3 nL spor süspansiyonu enjekte edilene kadar geri kırpmaya devam edin (burada, bu beş karmadır).
- Larvalar enjeksiyon plakası üzerinde düzenlenirken yanlışlıkla iğneye çarpmamak için mikromanipülatörü ve iğneyi yoldan çekin.
- Enjeksiyon plakasından E3-Trikain dökün, ardından ~ 24 anestezi uygulanmış larvayı bir transfer pipeti kullanarak mümkün olduğunca az E3 ile enjeksiyon plakasına aktarın.
- Zebra balığı larvalarını manipüle etmek için küçük bir alet (yani saç halkası aleti veya kirpik aleti) kullanarak larvaları baktıkları yöne göre düzenleyin. Özellikle, tümünü bir satırda sağa bakacak şekilde ve tümünü aşağıda bir satırda sola bakacak şekilde yerleştirin.
not: Plaka üzerinde çok fazla sıvı varsa, larvalar yerinden "yüzeceğinden" bu düzenleme zordur. Bununla birlikte, enjeksiyonlar uzun sürerse, larvalar kuruyabileceğinden veya anestezi yıpranabileceğinden, çok az sıvı da sorunludur. Bu nedenle, tüm mikroenjeksiyon işlemi boyunca plaka üzerindeki sıvı miktarına dikkat edilmelidir.
- Mikroskop yakınlaştırmasını en düşük büyütmeye ayarlayın. Mikromanipülatörü geri getirin ve iğne larvalara yakın olacak şekilde, görüş alanının ortasında ~ 30 ° –60 ° açıyla düzenleyin.
- En yüksek büyütme oranına yakınlaştırın ve iğnenin konumunu daha fazla ayarlamak için ince ayar düğmelerini kullanın. Spor süspansiyonunu larvaların yanındaki plakadaki sıvıya enjekte ederek ~ 30-70 sporun iğneden çıktığını doğrulayın. Gerekirse enjeksiyon kurulumundaki süreyi ve basıncı ayarlayın.
not: İğneden çıkan sporların sayısı zamanla artabileceği veya azalabileceği için bu test her beş ila altı larvada bir tekrarlanmalıdır.
- Larvaların iğneye doğru baktığı sıradan başlayarak, plakayı, iğne doğrudan yukarıda olacak ve ilk larvaların yanına gelecek şekilde hareket ettirin.
- İğneyi mikromanipülatör ile hareket ettirerek, iğneyi arka beyin ventrikülünü delmek için otik vezikülün etrafındaki dokudan geçirin. İğnenin açısı ile larvaların doğru yönünü elde etmek için plakayı diğer elinizle gerektiği gibi hareket ettirin.
- İğnenin ucunun arka beyin ventrikülünün merkezinde olduğunu görsel olarak doğrulayın, sporları enjekte etmek için ayak pedalına basın ve iğneyi nazikçe geri çekin.
not: Fenol kırmızı boya öncelikle arka beyin ventrikülü içinde kalmalıdır. Küçük bir miktar orta beyne gidebilir, ancak ön beyne veya beynin dışına ulaşmamalıdır. Varsa, enjekte edilen hacim çok büyüktür ve buna göre basınç ve süre azaltılmalı veya yeni bir iğne kalibre edilmelidir.
- Plakayı aşağı doğru hareket ettirerek, o sıradaki tüm larvaları enjekte edin. Daha sonra plakayı ters çevirin ve tüm larvaları diğer sıraya enjekte edin.
not: Başarısız bir şekilde enjekte edilen veya kazara hasar gören larvalar, 1) kırmızı bir işaret oluşturmak için yumurta sarısına birkaç kez enjekte edilerek veya 2) larvaları iğne ile sıranın dışına sürükleyerek işaretlenebilir.
- İğneyi tekrar yukarı ve yoldan çekin. Mikroskopta daha düşük bir büyütme oranına kadar uzaklaştırın. Fenol kırmızı boya, her larvanın arka beyninde hala görünür olmalıdır.
- İlk olarak, bir saç halkası aletiyle çekin ve başarısız enjeksiyonlarla larvaları atmak için pipetleyin. Kalan larvaları taze steril E3 ve bir transfer pipeti ile plakadan yıkayarak yeni bir Petri kabına aktarın.
- İstenen son deneysel numune numarası için gerektiği kadar tekrarlayın.
- Larvaları E3 ile en az 2 kez durulayın ve anesteziden iyileşmeyi sağlayın.
- Daha fazla tedavi olmadan sağkalımı ölçmek için, bir transfer pipeti kullanarak, larvaları E3'te 96 oyuklu bir plakaya (kuyu başına 1 larva) aktarın.
4. Enjekte edilen ve canlı spor sayılarının belirlenmesi
- Enjeksiyondan hemen sonra, bir transfer pipeti kullanarak, enjekte edilen larvaların yaklaşık sekizini rastgele seçin ve bunları 1.7 mL santrifüj tüplerine (tüp başına bir larva) aktarın.
- Larvaları tricaine ile veya 0,5-2,0 saat boyunca 4 ° C'ye koyarak ötenazi yapın.
- Steril 1x PBS'de 1 mL 1 mg / mL ampisilin ve 0.5 mg / mL kanamisin antibiyotik solüsyonları hazırlayın. Kalan çözelti 4 °C'de saklanabilir ve daha sonra kullanılabilir.
not: 100 mg / mL'de ampisilin ve 50 mg / mL'de kanamisin stok çözeltileri önceden hazırlanabilir, filtreyle sterilize edilebilir ve -20 ° C'de alikotlarda saklanabilir. Çalışma çözeltisini elde etmek için bu 100x'i 1x PBS'de seyreltin.
- Bir pipet kullanarak, larvaları geride bırakarak santrifüj tüpünden mümkün olduğunca fazla sıvı çıkarın ve antibiyotikli 90 μL 1x PBS ekleyin.
not: Antibiyotikler, Aspergillus kolonilerinin sayımına müdahale edebilecek GMM plakalarında bakteri üremesini önlemek için kullanılır.
- Larvaları 6 dakika boyunca 1.800 salınım / dak'da (30 Hz) bir doku parçalayıcıda homojenize edin. 30 saniye boyunca 17.000 x g'da döndürün.
- GMM plakalarını etiketleyin (homojenize larva başına bir plaka). Steril bir ortam oluşturmak için bir Bunsen brülörü kullanarak, homojenize süspansiyonu bir tüpten GMM plakasının ortasına pipetleyin, ardından tek kullanımlık L şeklinde bir yayıcı kullanarak yayın. Homojenatı kenara yaymaktan kaçının.
- Plakaları 2-3 gün boyunca 37 ° C'de baş aşağı inkübe edin ve oluşan koloni sayısını, koloni oluşturan birimi (CFU) sayın.
- Enfeksiyon döneminde canlı olan sporların sayısını ölçmek için, enjeksiyondan 1-7 gün sonra (dpi) 96 oyuklu plakalardan larvaları toplayın ve bunları santrifüj tüplerine aktarın. Adım 4.1-4.5'te açıklandığı gibi GMM plakalarına yayılmak için larvaları ötenazi yapın ve homojenize edin.
5. Enjekte edilen larvaların ilaç tedavisi
- 4. bölümden sonra, kalan enjekte edilen larvaları 3,5 mm'lik iki tabağa bölün: biri ilaç tedavisi ve diğeri kontrol için. Durum başına yaklaşık 24 enfekte larva kullanın.
not: 3,5 mm'lik bulaşıklar suda %2 yağsız kuru süt ile muamele edilebilir, durulanabilir, havayla kurutulabilir ve önceden RT'de saklanabilir. Sütle kaplamak larvaların plastiğe yapışmasını önleyecektir.
- İstenilen ilaç solüsyonunu ve aracı metilen mavisi içermeyen E3'te konik tüplerde gereken son konsantrasyona göre hazırlayın, ardından iyice karıştırın. Örneğin, deksametazona maruz kalan larvaların hayatta kalmasını izlemek için, deksametazon için 24 larva (replikasyon) ve dimetil sülfoksit (DMSO) gibi araç kontrolü için 24 larva (replikasyon) kullanın. İstenilen konsantrasyonda 5 mL ilaç çözeltisi hazırlayın. Burada 5 mL %0.1 DMSO ve 10 μM deksametazon kullanıldı ve 24 larva/durum ~200 μL'lik araç/ilaç solüsyonu/larvaya aktarıldı.
- Bir transfer pipeti ile bir tabaktan mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın ve önceden karıştırılmış E3 içeren araç kontrolünü ekleyin. Diğer yemek için ilgilenilen muameleyi içeren önceden karıştırılmış E3 ile tekrarlayın.
- Bir pipet kullanarak larvaları 96 oyuklu bir plakaya aktarın (kuyucuk başına bir larva). Araca veya ilaca maruz kalan enjekte edilen larvaların 7 gün boyunca hayatta kalmasını izleyin.
not: İlaç sadece enfeksiyon gününde uygulanabilir ve tüm deney boyunca larvalar üzerinde tutulabilir veya günlük olarak yenilenebilir.
>6. Zebra balığı Büyüme ve Görüntüleme için Yaralama ve Tuzak Cihazı (zWEDGI) kullanılarak enfekte larvaların günlük görüntülenmesi
- Pigmentasyonu önlemek için larvaların 24 hpf'de 100 μM N-feniltiyoüre (PTU) ile muamele edildiğinden ve PTU'nun tüm deney boyunca larvalar üzerinde tutulduğundan emin olun.
not: 75-100 μM'de PTU, herhangi bir büyük gelişimsel kusur olmaksızın larvaların pigmentasyonunu önler. Bununla birlikte, PTU bazı biyolojik süreçlere müdahale edebilir ve araştırmacılar, ilacın araştırılan herhangi bir işlemi etkileyip etkilemeyeceğini önceden belirlemelidir.
- Transgenik larvaları, bölüm 3'te açıklandığı gibi, bir floresan proteini eksprese etmek üzere tasarlanmış Aspergillus sporları ile 2 dpf'de ilgilenilen etiketli hücre popülasyonları ile enfekte edin. Daha sonra, enfekte larvaları metilen mavisi içermeyen yaklaşık 500 μL / E3 oyuğunda 48 oyuklu bir plakanın kuyularına aktarın.
not: Burada 48 oyuklu bir plaka kullanılır, çünkü tekrarlanan günlük görüntüleme sırasında larvaları içeri ve dışarı aktarmak daha kolaydır.
- Görüntüleme gününde, iki adet 3,5 mm'lik Petri kabı hazırlayın: biri 100 μM PTU ve diğeri E3-trikat ile.
- Bir zWEDGI cihazının odalarına E3-tricaine ekleyin. Stereo mikroskop altında, bir P100 mikropipet kullanarak odalardan ve sınırlama kanalından hava kabarcıklarını çıkarın. Tüm fazla E3-tricaine'i çıkarın, böylece sadece odalarda.
- Bir transfer pipeti kullanarak plakadan bir larva pipetleyin. Çıkarmak için çok fazla sıvı kullanılıyorsa, E3-PTU içeren 3,5 mm'lik bir tabağa pipetleyin. Ardından, mümkün olduğunca az sıvı kullanarak tekrar pipetleyin ve E3-trikaya aktarın.
- Anestezi için ~ 30 s bekleyin, ardından yaralama ve sıkışma cihazının yükleme odasına aktarın (örn., zWEDGI).
- Stereo mikroskop altında larvaları konumlandırın. E3-trikaini yaralama odasından çıkarmak için P100 mikropipetini kullanın ve larva kuyruğunu kısıtlama kanalına hareket ettirmek için yükleme odasına bırakın. Arka beynin ters çevrilmiş bir objektif lens ile görüntülenebilmesi için larvanın yan, sırt veya dorsolateral tarafına yerleştirildiğinden emin olun.
- Konfokal mikroskop ile görüntü larvaları.
- Görüntülemeden sonra, P100 pipeti ile larvaları kısıtlama kanalından yükleme odasına itmek için E3-trikaini yaralama odasına bırakın.
- Bir transfer pipeti kullanarak larvaları alın ve E3-Trikain ile Petri kabına geri aktarın. Mümkün olduğunca az sıvı kullanarak, E3-PTU ile Petri kabına aktarın. PTU'da durulayın ve 48 oyuklu plakaya geri aktarın.
