Böcek Pupalarında İnflamatuar Hücre Dinamiklerini Araştırmak için Fotokonversiyon Tekniği

Abstract

Kaynak: Weavers, H. ve diğerleri, Drosophila Pupa İçindeki İnflamatuar Hücre Dinamiklerinin Uzun Süreli İn Vivo İzlemesi.J. Vis. Uzm. (2018)

Video, Drosophila pupae'de inflamatuar hücre dinamiklerini incelemek için fotokonversiyonun kullanımını göstermektedir. Yeşil hemositler yaralı epitele çekilir, ardından uzak göç gelir. Fotokonversiyon, belirli hemositleri yeşilden kırmızıya kaydırarak hareket takibini kolaylaştırır.

Protocol

Bu protokol dört ana ardışık adımdan oluşur: (1) Drosophila stoklarının hazırlanması ve Drosophila pupalarının evrelenmesi, (2) Pupa diseksiyonu ve montajı, (3) Pupa yaralanması, (4) in vivo hızlandırılmış konfokal görüntüleme.

1. Drosophila stoklarının hazırlanması ve pupaların evrelenmesi

1. Uygun Drosophila stoklarını edinin (Giriş ve Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Uygun genotipteki genç sağlıklı yetişkin sinekleri toplayın.
   1. Sinekleri kısaca uyuşturmak için karbondioksit gazı pedleri ve uygun genotip veya cinsiyetteki sinekleri bir toplama şişesine aktarmak için ince bir boya fırçası kullanarak yetişkin sinekleri seçin.
   2. Maya ile desteklenmiş standart sinek gıda ortamı (mısır unu-pekmez-agar karışımı, Malzeme Tablosuna bakınız) içeren her şişeye 20 bakire dişi ve 20 erkek ekleyin.
3. Optimal pupa oluşumu için, yetişkin sinekleri her gün taze şişelerde yeni yiyeceklere yönlendirin ve tüm şişeleri 25 ° C'de tutun.
   not: Soya özgü gen ekspresyonunu sağlamak için Gal4 yukarı akış aktivasyon dizisi (Gal4-UAS) sistemi kullanılıyorsa, Gal25-UAS sistemi sıcaklığa duyarlı olduğundan tüm adımlar 4 °C veya üzerinde gerçekleştirilmelidir.
4. Planlanan görüntüleme seansından 18 saat önce, flakonlardan en az 10 yeni oluşturulmuş beyaz ön pupa (Şekil 1A) seçin (ör. puparium oluşumundan 0 saat sonra, APF) forseps veya ince bir boya fırçası kullanarak pupaları iç flakon yüzeyinden çıkarmak ve pupaları temiz boş bir plastik şişenin kenarına dikkatlice aktarın.
   not: Dolaşan 3^{. instar} larvaları, pupa olmak için besin ortamından yukarı doğru sürünür; Yeni oluşan beyaz prepupalar, everted anterior spiracles'e sahip oldukları ve sabit oldukları için (3. instar larvalarının aksine) kolayca^{tanımlanırlar}. Kütikül, başlangıçta yumuşak ve beyaz olan 'puparium'a (pupa kılıfı) dönüşür. Pupalara zarar vermekten kaçınmak için özen gösterilmelidir, çünkü bu sadece istenmeyen bir yaralanmaya bağlı enflamatuar yanıta değil, aynı zamanda önemli bir gelişimsel gecikmeye de yol açabilir.
5. Seçilen pupaları flakonda 25 ° C'de uygun gelişim aşamasına (18 saat APF en iyi sonuçları verecektir) yaşlandırın.
   not: Pupa geliştikçe, pupa vakası giderek daha koyu ve daha kırılgan hale gelecektir.
6. Bir sonraki adım için diğer reaktifleri önceden hazırlayın. Heptan tutkalı yapmak için, 20 cm uzunluğunda sarılmış çift taraflı bandı 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 20 mL heptan ile birleştirin, parafin filmle kapatın ve gece boyunca oda sıcaklığında tezgahta sallayın.

>2. Drosophila pupalarının hazırlanması ve diseksiyonu

1. Aşamalı Drosophila pupalarını bir cam slayt üzerine monte edilmiş çift taraflı yapışkan bant parçasına aktarın. Pupaları, ventral tarafı banda sıkıca yapışacak ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 1B).
   not: Pupa'nın ön kısmı, pupa vakasının ön ucundan çıkıntı yapan iki spiracle'den tanımlanabilir
.
2. Forseps ve mikro makas kullanarak parlak alan diseksiyon mikroskobu altında pupaları koruyucu puparium kılıflarından dikkatlice çıkarın (Şekil 1B-D).
   1. İlk olarak, forseps kullanarak puparyumun en ön bölgesinde bir kesi yapın (Şekil 1B). Bu bölgedeki pupa kılıfının içi boş ve pupa dokusundan yoksun olduğundan emin olun çünkü erken pupa gelişimi sırasında pupa kılıf içinde küçülmüş olacaktır.
   2. Bu ilk kesiden sonra, pupa kahverengi opak kırılgan kılıftan tamamen kurtulana kadar pupa kılıfını forseps veya mikromakas kullanarak önden arkaya yönde dikkatlice yırtın veya kesin (Şekil 1C).
      not: Bu aşamadaki pupalar çok kırılgandır ve pupa yüzeyinin delinmesini önlemek için özen gösterilmelidir; Hemolenf delinme bölgesinden hızla sızdığı için delinme açıktır. Ne kadar küçük olursa olsun, delinmiş pupalar atılmalıdır.
3. Pupaları heptan tutkalı kullanarak cam tabanlı bir tabağa monte edin.
   1. 20 mL'lik bir pipet ucu kullanarak 10 mL'lik önceden hazırlanmış heptan yapıştırıcıyı (yukarıdaki bölüm 1.6'ya bakın) cam tabanlı tabağın üzerine bir çizgi halinde yerleştirin.
   2. Disseke edilmiş pupaları forseps kullanarak dikkatlice heptan yapıştırıcı üzerine aktarmadan önce yapıştırıcının 5 saniye kurumasını bekleyin (Şekil 1E).
   3. Yaralama ve görüntüleme kolaylığı için, pupaları arka arkaya sıralayın; yaklaşık 5 pupa önerilir, ancak daha fazlası deneyimle yönetilebilir olacaktır.
      not: Dik görüntüleme sistemleri kullanılırken heptan yapıştırıcı kullanılması önerilir, ancak ters çevrilmiş bir sistem kullanılırken gerekli değildir. Yapıştırıcı görüntüleme sırasında optik sapmalar yaratırsa, pupa bunun yerine doğrudan kapak camının üzerine yerleştirilebilir - pupa dokusu ile cam arasındaki doğal yapışma, görüntüleme kabını mikroskoplar arasında hareket ettirirken dikkatli olunduğu sürece, çoğu durumda stabil görüntüleme için yeterli olacaktır.
4. En iyi sonuçlar için, pupaları, kanat yüzeyinin çoğunluğu kapak camı ile doğrudan temas halinde olacak şekilde kanat kapak camı üzerinde düz olacak şekilde monte edin (Şekil 1F). Kanadın doğru şekilde monte edildiğinden emin olmak için konumlarını değiştirmek için pupaları forseps kullanarak yuvarlayın.
5. Görüntüleme süresi boyunca numunenin dehidrasyonunu önlemek için, pupaları rahatsız etmemeye dikkat ederek, montajın sonunda cam tabanlı kabın yan tarafına damıtılmış suya batırılmış bir parça emici filtre kağıdı ekleyin (Şekil 1E). Çanağı bir kapakla örtün.
   not: Pupalar artık yaralama ve görüntüleme için hazırdır.

3. Drosophila Pupa Kanatlarının Lazer Kaynaklı Yaralanması

1. Monte edilmiş pupa içeren cam tabanlı çanağı, ayarlanabilir bir lazer ablasyon sistemi ile donatılmış geniş alanlı bir mikroskoba aktarın.
   1. 435 nm'ye ayarlanmış darbeli UV hava soğutmalı nitrojen pompalı ablasyon lazeri kullanın - ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın; aydınlatma için kullanılan ışığın kesin dalga boyu, kullanıcı tarafından uygun bir boya hücresi aracılığıyla seçilir.
2. Parlak alan optiklerini kullanarak, yaralanacak ilk pupanın pupa kanadını bulmak için mikroskop aşama kontrollerini ayarlayın (Şekil 1F).
3. En iyi sonuçlar için, hem görüntüleme hem de lazer ablasyonu için yağa daldırma 40X veya 63X objektif lens kullanın; Kullanılan daldırma sıvısının (yağ veya gliserol) ablasyon ve görüntüleme sistemleri arasında tutarlı olduğundan emin olun. İnce odak kontrol düğmesini kullanarak mikroskobu, cam lamele en yakın pupa kanat epitelinin düzlemine odaklanacak şekilde ayarlayın (yani, epitelin yaralanacak bölgesine odaklanın).
4. Mikroskop aşama ayarlamalarını kullanarak, pupa kanadını, yaralanacak alan ablasyon lazerinin bilinen hedef alanı ile doğrudan aynı hizada olacak şekilde konumlandırın.
5. Ablasyon ışığının güç seviyesini manuel olarak ayarlamak için mikroskoba takılan bir enerji yoğunluğu zayıflatıcı sürgü kullanın.
   not: Zayıflatıcı kaydırıcısı, göreli zayıflama düzeyini belirlemek ve tekrarlanabilir ayarların kullanılmasına izin vermek için tıklama duraklarına ve kararlarına sahiptir.
6. Harici bir manuel tetik kontrolü kullanarak, bir yara oluşturmak için tetiğe tek bir kısa tıklama kullanarak ablasyon lazerini etkinleştirin. Ablasyon bölgesinde geçici hava kabarcığının görünümünü kontrol edin, çünkü yaraya normalde onunla birlikte olacaktır. Pupa epitelini görselleştirmek için uygun floresan filtreleri kullanarak lazerin neden olduğu yaranın başarılı olup olmadığını kontrol edin.
   not: Işın yansımaları ciddi göz veya cilt hasarına neden olabileceğinden, lazer ışınlarına kazara maruz kalmaktan kaçının.
7. Yaralama başarısız olursa, odak düzlemini değiştirin (mikroskop odağını mevcut odak seviyesinin biraz üstüne veya altına hareket ettirin) ve ablasyon tetiğinin tek tıklamasını tekrarlayın. Alternatif olarak, istenen yara boyutu elde edilene kadar zayıflatıcı sürgüyü kullanarak lazer gücünü kademeli olarak artırın.
8. Ablasyon lazer darbe tekrarlama oranını değiştirmek için, arka kontrol panelindeki Tekrarlama oranı düğmesini kullanın (hızı 1 darbe/sn'den azdan 60 Hz'e değiştirir). Optimum yaralama için nabız tekrarlama oranını 40 Hz'e ayarlayın.
9. Farklı boyutlarda yaralar oluşturmak için, ablasyon ışığının güç seviyesini manuel olarak ayarlamak için enerji yoğunluğu zayıflatıcı sürgüsünü kullanın.
10. Monte edilmiş pupaların tümünü yaralamaktan kaçının ve bu ablasyonsuz pupaları yarasız kontroller olarak kullanın.
11. Tutarlı sonuçlar için, ablasyon sistemini düzenli olarak yeniden hizalayın (ilgili kullanım kılavuzunu kullanarak). Ayrıca, lazer çıkış dalga boyunu kontrol eden boya rezonatör hücresini temizleyin ve yeniden doldurun.

4. In Vivo Hızlandırılmış Konfokal Görüntüleme

1. Hızlandırılmış görüntüleme için cam tabanlı çanağı hızlı bir şekilde uygun bir mikroskoba aktarın.
   not: En iyi sonuçlar için, hem yeşil floresan proteini (GFP) hem de mCherry floroforlarını tespit edebilen hassas dedektörlerle donatılmış, yüksek özellikli bir konfokal veya dönen disk mikroskobu kullanın.
2. Pupa kanadının tamamını görüntülemek için düşük büyütmeli (örn. 20X) bir objektif lens kullanın (Şekil 2A). Yara onarımını ve beraberindeki inflamatuar yanıtı yüksek uzamsal çözünürlükle görüntülemek için, yağa daldırma 40X (NA 1.3) veya 63X (NA 1.4) objektif lenslerini kullanın (Şekil 2B-D'deki temsili resimlere bakın).
3. Mikroskopla ilişkili uygun görüntü yakalama yazılımını açın.
4. Görüntü yakalama yazılımını kullanarak, sırasıyla GFP ve mCherry floroforlarını görselleştirmek için 488 nm ve 561 nm lazerler gibi uygun lazerleri açın (ilgili kutulara tıklayarak) ve piksel doygunluğundan kaçınırken yeterli floresan sinyali vermek için lazer gücünü ve kazanç/ofset ayarlarını yapın; foto ağartma ve fototoksisiteyi en aza indirmek için mümkün olan en düşük lazer gücünü (%5 - 20 aralığında) kullanın.
5. Hem onarıcı epiteli hem de enflamatuar hücre alımını yakalamak için, mikroskobu kontrol panelindeki ince odak ayar düğmelerini kullanarak bir z-yığını kaydedecek şekilde ayarlayın; En iyi sonuçlar için, yazılımı (manuel düğme tıklamalarını kullanarak) pupa kanadından (en az her 3 mm'de bir), yaralı epitelin tepesinden alttaki hücre dışı boşluğa (göç eden hemositler içeren) kadar Z-dilimleri kaydedecek şekilde ayarlayın ve büyük bir Z-yığını (50 - 100 aralığında) elde edin mm).
6. Hızlandırılmış görüntüleme için, yaralanmadan en az 1 saat sonra düzenli zaman aralıklarında (en az her 30 saniyede bir) z-yığınlarını kaydedin.
   not: Seçilen z-yığınları arasındaki tam zaman aralığı, hızla değişen hücre dinamiklerini yakalamak ve numunelerin foto-ağartılmasından kaçınmak arasında bir dengeyi temsil eder.
7. Birden fazla pupayı aynı anda görüntülemek için (ablasyonsuz yarasız kontroller dahil), motorlu bir aşama (mikroskoba bağlı) ve görüntüleme yazılımında bulunan çok konumlu çekim özelliğini kullanın. Stage konum kontrol düğmelerini kullanarak yazılım içindeki her bir pupa'nın konumunu manuel olarak ayarlayın ve ardından her pupa için uygun z-yığını limitlerini (üst ve alt) manuel olarak ayarlayın.
8. Z-stack projeksiyonları veya 3D işlemeyi kullanarak özel görüntü analiz yazılımıyla (ImageJ gibi) zaman atlamalı görüntüleri görüntü yakalama sırasında veya daha sonra görselleştirin. Örneğin, tek tek hemositlerin hareketlerini takip etmek için (Şekil 2C' ve D'de olduğu gibi), açık erişimli ImageJ eklentileri "TrackMate" veya "Manual Tracking" ('de yayınlanan yöntemler) kullanarak hemosit çekirdeklerini takip edin.
9. Görüntüleme sırasında epitel veya bağışıklık hücrelerinin bir alt kümesini seçici olarak fotodönüştürmek ve etiketlemek için fotoconvertible problar (Kaede gibi) kullanın.
   1. Fotodönüşümü gerçekleştirmek için görüntüleme yazılımı içinde uygun modülleri açın (foto ağartma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP) ve foto-ağartma sonrası floresan geri kazanımı modülü gibi) ve 405nm lazeri etkinleştirin (ilgili yazılım kutusuna tıklayarak).
   2. Kare, dairesel veya serbest seçim aracını kullanarak FRAP yazılımı içinde fotodönüştürülecek hücreleri seçin. FRAP yazılımı içinde, fotodönüştürme (Ağartma) için zaman rotasını tek bir yineleme/kare olarak ayarlayın ve 405 nm lazeri %20 lazer gücüne ayarlayın. Fotoğraf dönüştürme gerçekleştirmek için Denemeyi başlat'ı manuel olarak tıklayın.
   3. FRAP modülünden çıkın (Kapat'a tıklayın) ve yazılım içindeki orijinal görüntüleme ekranına geri dönün; 488 nm ve 561 nm lazerleri kullanarak, yukarıdaki gibi bir z-yığını ve hızlandırılmış kayıt ayarlayarak fotoconvertlenmiş ve fotoconvertedilmemiş hücrelerin davranışını görüntüleyin.
      not: Fotokontenversiyonlu problar, ilk fotokonversiyondan sonra saatlerce stabil kalır ve fotokonvertiyonlu hücrelerin davranışının zaman içinde (en az 5 saat) takip edilmesini sağlar. Örneğin, yaradaki enflamatuar hücreler seçici olarak fotokonversiyon yapılabilir (Şekil 2F) ve davranışları yaralanma bölgesinden çözülürken takip edilebilir (Şekil 2G ve H).

Results

Şekil 1: Drosophila pupa yaralama ve canlı görüntüleme için preparat. (A) Drosophila white prepupae 0 h APF'de toplanır, ön ucu sürekli solunum ekleri (spiracles) ile gösterilir. (B) Beyaz 0 saatlik APF prepupalarını 25 ° C'de 18 saat yükselttikten sonra, puparium kahverengi görünür. Pupa olgusunun diseksiyonu en ön bölgeden (ok) başlamalı, bu bölged...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila hisse senetleri
Her yerde bulunan GFP etiketli E-cadherin; Ubi-p63E-shg.GFP; (bölüm II)	Kyoto Stok Merkezi, DGRC	#109007	Ubi-p63E promotör dizileri, GFP ile C-terminal ucunda etiketlenmiş Drosophila E-cadherin'in (av tüfeği) ifadesini yönlendirir.
Her yerde bulunan GFP etiketli E-cadherin;; Ubi-p63E-shg.GFP (III)	Bloomington Drosophila Stok Merkezi (Indiana Üniversitesi)	#58742	Ubi-p63E promotör dizileri, GFP ile C-terminal ucunda etiketlenmiş Drosophila E-cadherin'in (av tüfeği) ifadesini yönlendirir.
Her yerde GFP etiketli Moesin P{sGMCA}3.1	Bloomington Drosophila Stok Merkezi (Indiana Üniversitesi)	#59023	Her yerde ifade edilen sqh promotörü/arttırıcısı, GFPS65T ile etiketlenmiş bir Moesin parçasının (aktin bağlama dizilerini içeren) ekspresyonunu yönlendirir.
Hemosit spesifik yılan-Gal4 sürücüsü ; srp-Gal4;	Oluşturan Katja Bruckner	Oluşturan Katja Bruckner	Bir poliA kuyruğuna kaynaşmış Scer\GAL4 ekspresyonu, Drosophila yılanının yukarı akışından gelen 2 genomik dizi tarafından kontrol edilir. Referans: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. PDGF/VEGF reseptörü, Drosophila'da kan hücresi sağkalımını kontrol eder. Dev Hücresi. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nükleerRFP w1118;; P{UAS-RedStinger}6	Bloomington Drosophila Stok Merkezi (Indiana Üniversitesi)	#8545 veya #8547	UAS düzenleyici dizileri, C-terminal ucunda bir nükleer lokalizasyon sinyali ile etiketlenen RFP'nin DsRed.T4 formunun ifadesini yönlendirir
UAS-sitoplazmikGFP ;; P{UAS-GFP. S65T}	Bloomington Drosophila Stok Merkezi (Indiana Üniversitesi)	Birden fazla hisse senedi mevcut (ör. #1522)	GFP'nin S65T versiyonunun UAS düzenleyici dizileri ile ifadesi; S65T varyantı artan parlaklık sergiler.
UAS-foto dönüştürülebilirKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3	Bloomington Drosophila Stok Merkezi (Indiana Üniversitesi)	#26161	Kaede proteini, sentezden sonra parlak yeşil floresan yayar, ancak UV ile ışınlamada verimli bir şekilde parlak, stabil kırmızı bir floresana dönüşür.
GFP etiketli spagetti kabağı w1118;; P{sqh-GFP.RLC}	Bloomington Drosophila Stok Merkezi (Indiana Üniversitesi)	#57145	C-terminal ucunda bir T:Avic\GFPS65T etiketi ile etiketlenen sqh kodlama bölgesi, doğal sqh promotörün kontrolü altında ifade edilir.
Sinek gıda medyası için malzemeler			Sinek gıda ortamı standart prosedürlere göre yapılır (bakınız Greenspan, R. 1997. Sinek İtme: Drosophila Genetiğinin Teorisi ve Pratiği. Cold Spring Harbor Press. 1-191 s.)
mısır	Yabani Yulaf, Bristol, Birleşik Krallık (veya eşdeğer tedarikçi)	Tedarikçiyle doğrudan iletişime geçin	organik
Soya unu	Yabani Yulaf, Bristol, Birleşik Krallık (veya eşdeğer tedarikçi)	Tedarikçiyle doğrudan iletişime geçin	organik
Malt özü	Yabani Yulaf, Bristol, Birleşik Krallık (veya eşdeğer tedarikçi)	Tedarikçiyle doğrudan iletişime geçin	organik
pekmez	Yabani Yulaf, Bristol, Birleşik Krallık (veya eşdeğer tedarikçi)	Tedarikçiyle doğrudan iletişime geçin	organik
Difco agar	BD Biyobilimleri, Fisher Scientific	DF0142-15-2	Sinek yemi hazırlamak için
Propiyonik asit	Sigma	402907	Sinek yemi hazırlamak için
Nipagen	Sigma	79721	Sinek yemi hazırlamak için
Kurutulmuş ekmek mayası	Kızılyıldız, Dutscher Bilimsel, Birleşik Krallık Ltd	Kızılyıldız, Dutscher Bilimsel, Birleşik Krallık Ltd	Sinek yemi hazırlamak için
Numune hazırlama ve montaj
Parafilm Filmi	Sigma	P7793-1EA	Heptan tutkalının hazırlanması için
İnce samur boya fırçası	Daler-Rowney (veya eşdeğeri)	#0 veya 1
Forseps	Fisher Scientific (veya Güzel Bilim Araçları)	NC9404145	Dumont #5
Görüntüleme için cam tabanlı tabaklar	MatTek	P35G-0-10-C	En az 10 mm Microwell, 0,085-0,13 mm kapak camı, kaplamasız 35 mm petri kapları kullanmanızı öneririz. Daha büyük mikro kuyulara sahip çanaklar, artan sayıda pupanın tek bir deneyde monte edilmesini ve görüntülenmesini sağlayacaktır.
Heptan	Sigma	51730-5ML	Heptan tutkalının hazırlanması için
Çift taraflı yapışkan bant (ör. Scotch)	Ağar Bilimsel	AGG263	Heptan tutkalının hazırlanması için
50ml tüp (heptan tutkalı için)	Fisher Scientific'ten şahin tüpleri	14-432-22	Heptan tutkalının hazırlanması için
Cam mikroskop slaytları	Ağar Bilimsel	AGL4244	Drosophila pupae diseksiyonu için
Brightfield ile stereo mikroskop diseksiyonu	Leica (veya eşdeğeri)	M50	Drosophila pupae diseksiyonu için
Mikro makas	John Weiss Uluslararası	103123	Minyatür Araştırma Makası (düz)
Lazer ablasyon ve görüntüleme
Nitojen ablasyon lazeri	Spektrum-Fizik (veya Andor eşdeğeri)	Modeli: VSL-337ND-S	Yaralama için bu, geniş alan görüntüleme sistemine bağlanmalıdır
Çok lazerli konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM)	Leica (veya eşdeğeri)	Leica DMi8 ters epifloresan mikroskobuna (veya eşdeğerine) bağlı TCS AOBS SP8 veya SP5-II	İdeal olarak, çok bölgeli ve 'mozaik' tarama için motorlu bir aşama ve ayrıca 'hibrit' GaAsP dedektörleri (çok daha fazla hassasiyet ve düşük sinyalin artırılmasını sunan) içerir
Çevre odası	Life Imaging Services (veya eşdeğeri)	"Mikroskop Sıcaklık Kontrol Sistemi"	Görüntüleme sırasında sıcaklık kontrolü için Konfokal mikroskoba bağlı
Görüntü Analiz Yazılımı
FRAP yazılım modülü	Leica (veya eşdeğeri)	CLSM FRAP yazılım modülü	Kaede gibi fotokonvertibl floroforların fotodönüşümünü gerçekleştirmek için
ImageJ (görüntü analiz yazılımı)	Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Görüntüden GörüntüyeJ: 25 yıllık görüntü analizi". Doğa Yöntemleri 9, 671-675, 2012.
ImageJ eklentisi "Manuel İzleme"	Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ eklentisi "TrackMate"	GörüntüJ, NIH	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: Tek parçacıklı izleme için açık ve genişletilebilir bir platform.", Yöntemler 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (yüksek performanslı 3D görüntüleme yazılımı)	Perkin Elmer	Volosite 6.3	Görüntü analizi için
IMARIS (görüntü analiz yazılımı)	Bit düzlemi	Hücre Biyologları için IMARIS	Görüntü analizi için