1. Bakteri Kültürü ve Preparatları
>NOT: Bu protokolde kullanılan bakteri türü, kapsüllenmiş virülan bir suş olan B. anthracis Ames'tir. Bu türle yapılan tüm manipülasyonlar, uygun biyogüvenlik ve güvenlik izinleri gerektirir ve bir BSL-3 laboratuvarında bulunan bir Sınıf II veya Sınıf III biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. BSL-3 çalışması ve bakterilerle çalışırken kişisel koruyucu ekipman kullanımı için kurumsal işletim prosedürlerini izleyin.
- 37 g BHI tozunu 1 L suda çözerek ve 121 °C'de 15 dakika otoklavlayarak Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) suyunu hazırlayın. Et suyunu ortam sıcaklığında saklayın.
- Suda% 8 sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın ve 0.20 μm'lik bir filtre şırıngası kullanarak sterilize edin. Solüsyonu 4 °C'de saklayın ve 1 gün içinde kullanın.
- NBY agar plakaları hazırlamak için 8 g Besin Suyu, 3 g maya özü ve 15 g agar'ı 1 L suda karıştırın. 121 °C'de 15 dakika otoklavlayın. Petri kaplarına dökün ve katılaşmasına izin verin. Plakaları 4 °C.
'de saklayın
not: NBY agar plakaları sodyum bikarbonatlı veya sodyum bikarbonatsız olarak yapılabilir. Et suyu ve agar plakalarına sodyum bikarbonat ilavesi, kapsüllenmiş basillerden oluşan mukoid kolonilerin büyümesini indükler. Hem sıvı hem de katı ortamdaki nihai sodyum bikarbonat konsantrasyonu %0.8'dir.
- %50 otoklavlanmış BHI suyu, %40 FBS ve %10 sodyum bikarbonat çözeltisini (h/h) karıştırarak B. anthracis için kültür suyu hazırlayın.
not: Bu et suyu, kısa zincirli kapsüllenmiş basiller üretmek için formüle edilmiştir.
- Et suyunda kültürlemeden bir gün önce bir spor stoğundan bir NBY agar plakası üzerinde izolasyon için çizerek bir B. anthracis ana plakası hazırlayın. 37 °C'de inkübe edin.
- 30 mL kültür suyunu havalandırmalı 250 mL'lik bir şişeye birkaç B. anthracis kolonisi ile aşılayın.
not: Maksimum kapsüllenmiş basil üretmek için burada belirtildiği gibi belirli bir hacim-yüzey et suyu oranına ihtiyaç vardır.
- Et suyu kültürünü 125 rpm'de, 37 °C'de% 20 CO2 ve 18–24 saat nemde 18
çalkalayın
not: 37 ° C'den daha yüksek sıcaklıklarda büyüyen B. anthracis kapsül üretimini engelleyebilir.
- Fiksasyondan önce yeterli kapsülleme ve basillerin kısa zincirler halinde (1-5 basil/zincir) olmasını sağlamak için Hindistan mürekkebi ile negatif boyama kullanın (bkz. bölüm 2).
- Koloni oluşturan birimleri (CFU) belirlemek için, 100 μL kültürü 1:10 oranında Fosfat Tamponlu Salin (PBS) çözeltisinde seri olarak seyreltin ve koyun kanı agar plakaları üzerinde plaka kültürü seyreltmelerini yapın. 37 ° C'de 12-18 saat inkübe edin. CFU'ları sayın ve mL kültür başına bakteri sayısını belirleyin.
not: Bakteriler düzeltildikten sonra mikroskop altında bir hemositometre kullanılarak da sayım yapılabilir. Bununla birlikte, basillerin düşük büyütme altında görülmesi zor olduğu için bu önerilmez.
- Basili sabitlemek için %4'lük bir son konsantrasyonda bakteri kültürünün tüm hacmine %16 paraformaldehit (PF) ekleyin. 7 gün boyunca ortam sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde yavaşça çalkalayın.
not: % 4 PF'de yedi günlük inkübasyon, vejetatif basillerin sabitlenmesi için Amerika Birleşik Devletleri Ordusu Tıbbi Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma Enstitüsü (USAMRIID) kurumsal standart işletim prosedürüne dayanmaktadır.
- Fiksatifi çıkarmak ve steriliteyi test etmek için, 50 mL'lik konik bir tüpte 4 mL (% 10 hacim) sabit bakteri süspansiyonunu ≥3000 x g'da 45 dakika santrifüjleme ve PBS ile 30 mL / yıkama kullanarak üç kez yıkayın. Kalan numuneyi 4 °C.
'de %4 PF'de saklayın
not: Peletlemeden sonra, bir kapsülün varlığından dolayı bakteri peleti kabarıktır. Yıkama sırasında peleti rahatsız etmemeye özen gösterin. Canlılık testine müdahale etmemesi için tüm fiksatiflerin çıkarılması gerekir. Gerekirse, yıkama sayısını artırın.
- Canlılık testi için, 40 mL bakteri üreme ortamının (örneğin BHI suyu) 4 mL yıkanmış süspansiyon (et suyu hacminin ≤% 10'u) ile aşılayın ve 7 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bulanıklığı ölçmek için 600 gün önce ve sonra 7 nm'de optik yoğunluğu kontrol edin.
- Et suyu kültüründe 7 günlük inkübasyondan sonra, ≥100 μL et suyunu bir agar plakasına koyun ve 7 gün daha inkübe edin. Bulanıklıkta herhangi bir artış ve plakalarda büyüme görülmezse, orijinal kültür steril olarak kabul edilir ve bir BSL-2 laboratuvarına aktarılabilir.
NOT: Federal Seçilmiş Ajan Programı, inaktive edilmiş B. anthracis'in ancak numunenin tam sterilitesini gösterdikten sonra BSL-3 laboratuvarlarından transfer edilebilmesini zorunlu kılar. İnaktive edilmiş B. anthracis için canlılık testi, numunenin %10'unun 7 gün boyunca et suyunda kültürlenmesini ve ardından 7 gün daha katı bir ortamda kültürlenmeyi içerir. Sterilite oluşturulduktan sonra transfer onayı almak için kurumsal yönergeleri izleyin.
2. Kapsülleme ve basil zincirlerini gözlemlemek için negatif boyama ve ışık mikroskobu
- 5 μL bakteri süspansiyonunu 2 μL Hindistan mürekkebi ile bir mikroskop lamı üzerinde karıştırın. Süspansiyonun üzerine kabarcık oluşturmadan 1 veya 1,5 μm kalınlığında bir kapak camı yerleştirin.
not: Kapak camını lam üzerine kapatmak için oje kullanılabilir.
- Işık mikroskobu üzerinde 40x ila 100x yağ objektif lensi kullanarak bakteri süspansiyonunu gözlemleyin. Her bir bakteriyi çevreleyen bir boşluk bölgesini (kapsül Hindistan mürekkebini içermez) gözlemleyerek basillerin kapsüllendiğinden ve basil zincirlerinin kısa olduğundan emin olun.
3. Bakterilerin FITC etiketlemesi
- Floresein izotiyosiyanatı (FITC) dimetil sülfoksit içinde 2 mg / mL konsantrasyonda çözün.
- İnaktive edilmiş bakteri stoğunun hacmini ölçün.
- Sabitleyiciyi çıkarmak için stoğu PBS'de 3 kez yıkayın.
- 75 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda FITC çözeltisi ekleyin. Karışımı 4 °C'de 18-24 saat yavaşça çalkalayın.
- Bakterileri ≥3000 x g, 45 dakika peletleyerek ve fazla FITC'yi çıkarmak için 30 mL PBS / yıkama kullanarak üç kez yıkayın. Yıkama sırasında kabarık peletin rahatsız edilmediğinden emin olun. PBS'deki basili aynı başlangıç hacminde yeniden askıya alın.
- Basili çıkarın ve kullanana kadar -20 ° C'de mikrotüplerde saklayın. Basilin kapsülünü kaybedebileceğinden basili birden çok kez dondurmayın/çözmeyin.
4. Bakteriyel Opsonizasyon
- Isı, küçük bir hacimdeki test serumlarını (insan olmayan primatlardan, NHP'lerden) 56 ° C'de bir ısı bloğunda 30 dakika boyunca etkisiz hale getirir.
- FITC etiketli bakterileri 15000 x g'da 3-5 dakika peletleyerek PBS 2x ile çözün ve yıkayın. Aynı başlangıç hacminde PBS'de yeniden süspansiyon haline getirin.
- 96 oyuklu yuvarlak bir alt plakada (plaka # 2), test serumlarını hücre ortamında seri olarak seyreltin. Başka bir 96 oyuklu yuvarlak alt plakada (plaka # 3), her bir oyuğa 10 μL seyreltilmiş test serumu ekleyin.
not: Her plakada, negatif kontroller olarak seyreltilmiş test serumları yerine PBS ve normal maymun serumları dahil edildi. Ayrıca, farklı günlerde yapılan tüm tahlilleri normalleştirmek için standart bir eğri oluşturmak için pozitif kontrol olarak bir test serumu seçtik. Pozitif kontrol testi serumu, bol olduğu için keyfi olarak seçildi.
- Plaka #3'e 10 μL taze sulandırılmış bebek tavşan tamamlayıcısı ekleyin.
not: Sulandırıldıktan sonra, kalan yavru tavşan tamamlayıcısını atın; Tekrar dondurmayın ve çözmeyin.
- Plaka #3'e, 1:20'lik bir enfeksiyon çokluğu için uygun hacimde FITC etiketli basil ekleyin. Örneğin, 5 x 10 4hücre için 5 x 104 x 20 basil içeren birimi ekleyin. Plaka #3'teki her bir oyuğu, toplam 105 μL.
olacak şekilde uygun hacimde hücre ortamı ile doldurun
not: Hücreleri içeren plaka #1, 100 μL opsonize bakteri alır ve kalan 5 μL'si boşluk hacmi olarak kabul edilir. Test serumlarının her bir seyreltmesini iki kez test ettik.
- Plaka #3'ü 37 ° C'de 30 dakika boyunca% 5 CO2 varlığında basili opsonize etmek için nem ile inkübe edin.
5.Memeli hücrelerinin Yapışma Testi ve Floresan Etiketlemesi
- Kullanmadan önce tüm reaktifleri 37 °C'de muhafaza edin.
- Yapışkan hücreler içeren plaka #1'i 37 °C'lik bir ısı bloğuna yerleştirin.
- Harcanan ortamı kuyulardan çıkarmak için çok kanallı bir pipetleyici kullanın ve hızlı bir şekilde plaka #3'ten 100 μL opsonize bakteri ile değiştirin. Pipetleme sırasında kuyucuklarda kabarcık oluşmadığından emin olun. Yapışma için plaka #1'i 37 °C'de %5 CO2 ve nem ile 30 dakika inkübe edin.
- Bağlanmamış basilleri çıkarmak için her bir kuyuyu 37 °C'lik bir ısı bloğunun üzerinde 150 μL PBS ile 5x yıkayın.
not: Yıkama sırasında hücrelerin yanlışlıkla dağılmamasını sağlamak için özen gösterilmelidir.
- % 4 PF yapmak için% 16 PF'yi PBS 1: 4 ile seyreltin. Her kuyucuğa 150 μL ekleyerek 1 saat boyunca% 4 PF ile hücreleri sabitleyin. Hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın.
- 2 μL HCS (yüksek içerikli tarama) Turuncu Hücre Lekesini 10 mL PBS'de karıştırın. Bu boyama solüsyonundan 150 μL'yi sabit hücrelere ekleyin ve ortam sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Kuyuları 2x PBS ile yıkayın.
- Mikroskopi oluşana kadar 4 °C'de saklayın.
>6. Mikroskopi
>NOT: Genel olarak, yüksek verimli bir otomatik floresan mikroskobu, OAA için görüntülemeyi kolaylaştıracaktır. Otomatik bir sistem mevcut değilse, yapışık basillerin floresan görüntüleri manuel olarak alınabilir. Bu çalışmada, yapışık basiller ve hücre tek tabakaları, özel ekipmanlarla Zeiss 700 lazer tarama mikroskobu sistemi kullanılarak görüntülendi; sistemimiz otomatik bir tabla ile donatılmış Zeiss Axio Observer Z1 ters mikroskop, Kesin Odak modülü, 40 x NA 0.6 objektif, Axio Cam HRc kamera ve Zen 2012 (Blue Edition) yazılımından oluşuyordu. Elde edilen görüntüler konfokal görüntüler değil, geniş alan görüntüleridir. Aşağıdaki protokol, çeşitli otomatik mikroskopi sistemlerine uygulanabilen temel bir mikroskop kurulumu olarak tasarlanmıştır.
- Plaka #1'i ortam sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Mikroskobu ve ilgili ekipmanı açın.
not: Ortam sıcaklığındaki iklimlendirme, görüntüleme sırasında cam plaka üzerinde yoğuşma oluşmasını önler. Ek olarak, sıcaklık değişimlerinden kaynaklanan bulanıklaşmayı önler.
- Plakayı sahne alanına yerleştirin ve parlak bir alan veya faz kontrastı kullanarak hücrelere odaklanın.
- Plaka ayarı olarak 96 kuyu formatını seçin. Kanal ayarlarını seçin.
not: FITC'nin tepe uyarma ve emisyon dalga boyu 495/519 nm'dir; HCS turuncu hücre lekeleri 556 ve 572 nm'dir. Mikroskopta bulunan filtrelere bağlı olarak başka floroforlar da kullanılabilir.
- Döşeme modu olarak ayarı seçin. Alınacak görüntü sayısını belirtin.
not: Döşeme işlevi, bir numune kuyusunda birden fazla konumun yakalanmasına olanak tanır ve döşeme veya rastgele bir formatta bir görüntü elde etmek için ayarlanabilir. Kuyu başına 10 rastgele alan görüntüledik.
- Alım modunu "siyah beyaz" veya "monokrom" olarak değiştirin ve 2x2.
≥ gruplama
not: Gruplamayı 1x1'den 2x2 veya 4x4'e ayarlamak mikroskopi hızını artıracak, ancak aynı zamanda görüntünün daha düşük çözünürlüğüne neden olacaktır. OAA için, tahlil hem makrofajları hem de yapışan bakterileri numaralandırdığı için bu ayarların kullanılması yeterlidir.
- Otomatik odaklama veya odaklama modülünü açın. Otomatik odaklama işlevinin ne sıklıkla gerçekleştirileceğini belirtin. Varsa, Z yığını işlevini açın. Hücre tek tabakasının ve yapışık basillerin kalınlığını yakalayacak Z yığınlarının sayısını belirtin.
not: Seçilen Z yığınlarının sayısı mikroskopi süresini artıracak, ancak her Z yığınında doğru odaklamaya sahip bir görüntünün çekilmesini sağlayacaktır.
- Görüntülerin kaydedileceği bir dosya klasörü belirleyin. Otomatik görüntüleme programını çalıştırın.
