Fotoaktifleştirilebilir Peptit MHC ile Kontrollü T Hücre Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Sanchez, E., et al. Fotoaktive Edilebilir Bir Agonist Kullanarak T Hücresi Aktivasyonunun Uzamsal ve Zamansal Kontrolü. J. Vis. Uzm. (134), (2018)

Bu video, UV ışınlaması kullanarak fotoaktifleştirilebilir bir peptit-majör histouyumluluk kompleksinin deşifre edilmesi yöntemini göstermektedir. Boşaltma işlemi, doğal peptit dizisini ortaya çıkararak hassas T hücresi aktivasyonunu mümkün kılar.

Protokol

1. Uyarıcı Cam Yüzeylerin Hazırlanması

1. Damıtılmış, deiyonize suda (ddH₂O) 1:500 oranında seyreltilmiş biyotinile poli-L-lizin (Bio-PLL) ile sekiz kuyu odacıklı kapak camı kaplayın. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.
2. H₂O ile yıkayınız.
3. RT'de 2 saat kurutun.
4. RT'de 30 dakika boyunca Bio-PLL kaplı yüzeyleri bloke edici tampon (HEPES tamponlu salin [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], %2 BSA ile) ile bloke edin.
   1. 5 mg poli-L-lizin hidrobromürü 1 mL 10 mM NaPO4, pH 8.5 içinde çözün.
   2. 125 μmol (0.55 mg) NHS-biotin (DMSO'daki 100 mg / mL stoktan) ekleyin ve reaksiyonun pH'ını kontrol edin. PH 8.5'in altındaysa, pH 8.5 ile 9.5 arasına yükseltmek için 2 μL 4 N NaOH ekleyin.
   3. 30 dakika boyunca girdap.
   4. Reaksiyonu 20 mM Tris pH 8.0 içinde çözünmüş 50 μL 100 mM glisin ile söndürün.
   5. 10 dakika boyunca tam güçte döndürün ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
      NOT: Biyo-PLL kalitesi tipik olarak, malzemenin seri iki kat seyreltmelerinin 96 oyuklu bir ELISA plakasına kaplanması ve alkalin fosfataz bağlı streptavidin ile inkübasyondan sonra biyotin içeriğinin ölçülmesiyle önceki preparatlarla karşılaştırılır.
5. Engelleme arabelleğini çıkarın. Kuyuların kurumasına izin vermeyin. Streptavidin ekleyin (bloke edici tamponda 100 μg / mL). 4 °C'de 1 saat inkübe edin.
6. HBS'de yıkayın. Hazne kaydırma kuyularını 4-5 kez doldurun ve ters çevirin, HBS'yi kuyulardan çıkarın. Kuyuların kurumasına izin vermeyin.
7. Biyotinile pMHC ligandlarını ve adezyon moleküllerini yüzeye ekleyin.
   not: MCC ve OVA, orto-nitrobenzil bazlı koruma grupları (örneğin, nitrofeniletil (NPE) veya nitroveratriloksikarbonil (NVOC)) anahtar lizinlerin ε-amino grubuna (MCC'de K12, OVA'da K7) eklenerek fotokafeslenebilir. Fotokafesli MCC ve OVA, ticari satıcılardan temin edilebilir. Sulu tamponda sulandırıldıktan sonra, yerleşik yaklaşımlar kullanılarak bakteriyel olarak eksprese edilen I-E^k ve H2-K^b'ye yeniden katlanırlar.
8. Fotoaktifleştirilebilir MCC veya OVA peptidinin doğrulanması
   1. RT'de 20 dakika boyunca elde taşınan bir UV lambası (Malzeme Tablosuna bakınız) ile UV ışınlaması yaparak NVOC korumalı peptitleri azaltın.
   2. 1.0 μM uyarıcı olmayan peptit ile 5^{x 1 5} APC (negatif kontrol, ör. Hb), ışınlanmamış fotoaktif peptit, ışınlanmış fotoaktif peptit ve agonist peptit (pozitif kontrol, ör., MCC) 37 ° C'de 1 saat ila gece boyunca.
   3. 5C'yi eksprese eden T hücrelerini uyarmak için. C7 / 2B4 / VE TCR, CH12 veya CH27 B hücrelerini kullanın. OT1 T hücrelerini uyarmak için RMA-s veya EL4 timoma hücrelerini kullanın.
   4. Darbeli APC'leri, 200 μL'lik bir nihai hacimde 96 oyuklu yuvarlak alt plakalarda eşit sayıda T hücresi ile karıştırın. 37 ° C'de 12 - 24 saat inkübe edin.
   5. Her kuyucuktan süpernatanları geri kazanın ve streptavidin-yaban turpu peroksidaz kolorimetrik tespiti ile IL-2'yi ELISA ile analiz edin.
      NOT: MHC komplekslerine yeniden katlanmadan önce tüm peptitlerin kafesleme durumunun elektrosprey kütle spektrometresi ile doğrulanması şiddetle tavsiye edilir.
9. Işığa maruz kalmayı en aza indirmek için MHC'nin katlanmasını ve saflaştırılmasını gerçekleştirin. Örneğin, katlama reaksiyonlarını alüminyum folyoya sarın ve UV lambası kapalıyken jel filtrasyon kromatografisi gerçekleştirin.
   not: Fotoaktive edilebilir MCC-I-E^k ve OVA-H2-K^b'nin, muhtemelen eksik fonksiyonel kafesleme nedeniyle, yüksek yoğunlukta UV'den bağımsız T hücresi aktivasyonunu indüklediği bulunmuştur. Bu nedenle, fotoaktive edilebilir pMHC, immobilizasyon adımı sırasında 10 - 30 kat fazla uyarıcı olmayan pMHC'ye (ör. hemoglobin peptidi (Hb) içeren I-E^k) seyreltilir. Bu, sonraki görüntüleme deneyinin sinyal-gürültü oranını artırır.
10. CD4 ⁺ T hücrelerini fotoaktive etmek için, toplu olarak biyotinile Hb-I-Ek (3 μg / mL), biyotinile fotoaktif MCC-I-E^k (0.1 μg / mL) ve sınıf I MHC H2-K^k'ye (0.5 μg / mL) karşı biyotinile antikor karışımı kullanın. Anti-H2-K^k antikoru 5C'yi teşvik eder. H2-K k eksprese eden C7/2B4/AND T hücreleri aktivasyona uğramadan cam yüzeye yayılır.
11. CD8 ⁺ T hücreleri için, peptit KAVYDFATL (1 μg / mL), biyotinile fotoaktif OVA-H2-Kb (0.1 μg / mL) ve adezyon molekülü ICAM-1'in hücre dışı alanını (böcek hücre kültürü tarafından üretilen 2 μg / mL) taşıyan biyotinile H2-Db karışımı kullanın. ICAM-1, LFA1 integrinini T hücresi yüzeyine yerleştirerek yakın temas oluşumunu teşvik eder.
12. Tüm protein karışımlarını bloke edici tamponda uygulayın, ardından RT'de 1 saat veya 4 ° C'de en az 2 saat inkübe edin.
    not: Bu tür yüzeylerdeki moleküler yoğunluğun μm2 başına ~8000 olacağı daha önce belirlenmiştir. Fotoaktive edilebilir pMHC'nin yüzeydeki biyotinillenmiş proteinin ~ 1 / 30'unu temsil ettiği göz önüne alındığında, yoğunluğu, dekalizasyondan önce μm2 başına ~ 267 molekül olacaktır.
13. Adım 1.6'daki gibi yıkayın ve kullanıma hazır olana kadar HBS'de bırakın.
14. Her bir oyuğa uygun TCR'yi eksprese eden 200.000 CD4 ⁺ veya CD8 ⁺ T hücresi ekleyin ve hücrelerin 37 ° C'de 15 dakika boyunca yapışmasına izin verin. Hücreler yüzeye yapıştıktan ve yayıldıktan sonra, fotoaktivasyon ve görüntüleme için hazırdırlar.
    not: Efektör T hücrelerinin floresan görüntüleme probları ile retroviral transdüksiyonu başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Kalsiyum sinyali, kalsiyuma duyarlı boya Fluo-46 ile yüklenen transdüksiyonsuz T hücreleri kullanılarak da incelenebilir. Oransal boya Fura-2 tavsiye edilmez, çünkü UV aralığında uyarma gerektirir, bu da fotoaktive edilebilir pMHC'nin azalmasına neden olur.

2. Görüntü Edinme

1. Görüntü elde etmek için UV uyumlu 150X objektif lens ile donatılmış ters çevrilmiş bir TIRF mikroskobu kullanın. 100 W cıvalı lambaya (HBO) bağlı bir dijital diyafram sistemi kullanarak kullanıcı tanımlı bölgeleri UV ışınlayın. Bu lambadan gelen UV ışığını 400 nm uzun geçiren bir ayna kullanarak numuneye yönlendirin.
2. Lokalize fotoaktivasyon ve hızlandırılmış çekim için görüntü analiz yazılımı kullanın. Çoğu deneyde, sırasıyla 488 nm ve 561 nm uyarma lazerleri kullanarak hem yeşil hem de kırmızı kanallardaki probları izleyin. Lazer ışığı, aynı zamanda UV aralığında da iletim yapan çift bant geçişli bir dikroik ayna kullanılarak numuneye yönlendirilir (dekaging'i etkinleştirmek için). Mikroskop konfigürasyonu hakkında ek bilgi için lütfen Malzeme Tablosuna ve Şekil 1'e bakın.
3. T hücrelerini içeren hazne sürgüsünü monte ettikten sonra, gerektiği gibi TIRF veya epifloresan aydınlatması elde etmek için ayarları yapın. Canlı modda, ilgilenilen floresan probu/probları ifade eden bir hücre alanı seçin. Yazılım kontrolünü kullanarak tek tek hücrelerin altında fotoaktivasyon için mikron ölçekli bölgeler oluşturun.
4. Zaman atlamalı alıma başlayın. Tipik olarak, her bir zaman noktası arasında 5 sn aralıklarla 80 zaman noktası elde edilir. Bu, çift renkli deneyler söz konusu olduğunda, sıralı 488 nm ve 563 nm pozlamalar için fazlasıyla yeterli zaman bırakır.
5. 10 zaman noktasından sonra, dijital diyafram deklanşörünü 1 - 1,5 saniye açarak seçilen bölgeleri fotoetkinleştirin.
6. Hızlandırılmış çekim tamamlandıktan sonra, yeni bir hücre alanı seçin ve işlemi tekrarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Fotoaktivasyon ve TIRF görüntüleme için mikroskop konfigürasyonu.

488 nm ve 561 nm lazerler, yeşil ve kırmızı probların TIRF ve epifloresan görüntülemesi için kullanılır. Fotoaktivasyon için UV ışığı, küçük, kullanıcı tanımlı bölgeleri aydınlatabilen bir dijital diyafram sistemine bağlı bir cıva (Hg) lambasından alınır. Hg lambasından/diyaframından gelen ışık, görü...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak Camı	Thermofischer Bilimsel	155361
Poli-L-lizin hidrobromür	Sigma-Aldrich	P2636 Serisi	Biyotinile Poli-L-Lizin yapması gerekecek
EZ-Link NHS-Biyotin	Thermofischer Bilimsel	20217	Biyotinile Poli-L-Lizin yapması gerekecek
Streptavidin	Thermofischer Bilimsel	434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligaz standart reaksiyon kiti	Heves	BirA500	Proteinleri biyotinillemek için kullanılacak
Biyotinile Hb I-EK			Protein katlanması için referans 6'ya bakın. Biyotinilasyon için BirA kitini kullanın
Biyotinile NPE-MCC I-EK	Anaspec (Anaspec		Özel NPE-MCC (HANERADLIAYL-K (Nvoc) -QATKOH) Anaspec'ten satın alınabilir
Biyotinile αH2-Kk antikoru	BD Biyolojik Bilimler	553591
Biyotinile NPE-OVA H2-Kb	Anaspec (Anaspec		Özel NPE-OVA (H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH) Anaspec'ten satın alınabilir
Biyotinile KAVY H2-DB	Anaspec (Anaspec		Özel sentezlenmiş protein (KAVYDFATL) Anaspec'ten satın alınabilir
Biyotinile ICAM1			Protein katlanması için protokoldeki referansa bakın. Biyotinilasyon için BirA kitini kullanın
El tipi UV lambası	UVP (Nükleer Enerji)	UVGL-25	Lamba numuneden 1 cm uzakta < tutulur. Algılanabilir ölçüm için 30 sn 365 ışık, kantitatif ölçüm için 20 dakika yeterlidir.
Olympus IX-81 OMAC TIRF sistemi.	Olympus		Görüntüleme sistemi hakkında daha fazla bilgi Şekil 6'da bulunabilir
Mozaik dijital diyafram	Andor
Slayt kitabı yazılımı	Akıllı Görüntüleme İnovasyonları