$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. İnsan CD4+ Th1 Efektör/Bellek T Hücrelerinin Hazırlanması
- Vericinin koluna bir turnike uygulayın, damarı alkolle silin ve bir iğne yerleştirin. EDTA'yı antikoagülan olarak kullanarak 15 ml kanı yavaşça bir vakutainer içine çekin. Kan çekildiğinde, iğneyi çıkarmadan önce turnikeyi çözün. İğne çıkarıldığında hemen steril gazlı bez ile yaraya baskı uygulayın.
- Kanı 50 ml'lik bir tüpe aktarın. RT'de 1: 1 seyreltmede (son hacim 30 ml) RPMI-1640 ekleyin. Seyreltilmiş kanı, RT'de Ficoll-Paque gibi 15 ml önceden filtrelenmiş lenfosit izolasyon ortamı içeren iki adet 50 ml'lik tüpe dikkatlice yerleştirin.
- Sallanan bir kova rotorunda gradyanı RT'de 30 dakika boyunca 1,200 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında T hücre ortamını hazırlayın (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml penisilin / streptomisin).
- 50 ml'lik tüpün santrifüjden çıkarılmasından sonra, dört katmanı gözlemleyin: altta bir kırmızı kan hücresi topağı, paque, beyaz kan hücreleri (lenfositler dahil) içeren bir hücre tabakası ve plazma. Beyaz kan hücresi tabakasını bir Pasteur pipeti ile dikkatlice çıkarın ve 50 ml'lik bir Falcon tüpüne aktarın.
- RT RPMI-1460 (20 ml'ye kadar) ekleyerek ve RT'de 1.200 x g'da 5 dakika santrifüjleyerek beyaz kan hücresi tabakasını yıkayın. Beyaz kan hücrelerini 1 ml T hücresi ortamında yeniden süspanse edin. 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpünde 250 μl T hücre ortamına 5 μl 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin ve pipet ile hafifçe yukarı ve aşağı karıştırın.
- 25 μl% 0.4 Tripan mavisine 25 μl seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin. Standart bir hemositometrenin her iki tarafına 10 μl karışım ekleyin.
- Hemositometreyi düşük güçlü bir ışık mikroskobuna yerleştirin. 10X'lik bir objektif kullanarak, Tripan mavisi boyasını dışlayan ve hemositometrenin her iki tarafının orta karesinde bulunan canlı hücrelerin sayısını sayın.
- Hücre konsantrasyonunu hesaplamak için 2 karenin ortalamasını 100 (seyreltme faktörü) ile çarpın ve ardından hücre/ml sayısını vermek için 104 ile çarpın.
- Son konsantrasyonu T hücresi ortamında 0.5 x 106 hücre / ml'ye ayarlayın. Hücrelere bakteriyel süperantijenler, stafilokok, enterotoksin B (SEB) ve toksik şok sendromu toksin 1'in (TSST) her biri 1 μg / ml'lik bir son konsantrasyon ekleyin. CD4 + T hücre popülasyonunu genişletmek için 72 saat (37 ° C ve% 5 CO2) kültür.
- Pelet T hücreleri (1.200 x g, 5 dk) ve insan IL-15 (20 ng / ml) ilavesiyle T hücresi ortamında 0.5 x 106 hücre / ml'de yeniden süspansiyon haline getirilir. Lenfositleri bir T150 şişesine aktarın. Gerektiğinde her 24-48 saatte bir hücreleri tam orta-IL-15'te genişletmeye/bölmeye devam edin (ortam rengine bağlı olarak; yani, medya pembeden hafif sarıya döndüğünde) bundan sonra. Elde edilen lenfosit popülasyonunu 15 güne kadar koruyun.
not: Tasarım gereği, bu protokol özellikle SEB ve TSST'ye reaktif olan CD4 + T hücrelerinin bir alt kümesini aktive edecek ve genişletecek ve daha sonra bunları Th1 benzeri bir efektör / bellek fenotipine doğru yönlendirecektir. Diğer beyaz kan hücreleri bu koşullar altında hayatta kalamaz ve büyüyemez, öyle ki adım 1.10'da hücreler en az% 95 CD4 +, CD45RO + T hücreleri olacaktır, akış sitometrisi ile kolayca değerlendirilebilir. İstenirse, ticari olarak temin edilebilen antikor/manyetik boncuk bazlı pozitif veya negatif seçim kitleri aracılığıyla daha fazla saflaştırma kolayca sağlanabilir.
2. Primer İnsan Endotel Hücre Kültürünü Başlatma
- Steril koşullarda PBS'de bir T25 şişesini fibronektin (FN) 20 μg/ml ile kaplayın. RT'de 30-60 dakika bekletin. FN'yi çıkarın ve 5 ml tam ortam ekleyin (Endotelyal Bazal Ortam (EBM-2) ortamı, Endotelyal Büyüme Ortamı (EGM-2) singlequots ile desteklenmiştir). 37 ° C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe en az 30 dakika önceden inkübe edin.
- Donmuş insan akciğeri veya dermal mikrovasküler endotel hücrelerinin (HLMVEC'ler veya HDMVEC'ler) bir şişesini 37 ° C'lik bir su banyosunda ara sıra ~ 2-3 dakika boyunca hafif çalkalama ile çözün. Hücreleri hemen önceden ısıtılmış ortam içeren T25 şişesine aktarın. Yavaşça döndürün ve 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin.
- Medyayı ~ 4-6 saat sonra değiştirin. Plaka ~% 90-95 birleşime ulaşana kadar medyayı yaklaşık olarak her 48 saatte bir (veya medya hafifçe sarı olduğunda) değiştirmeye devam edin.
3. Endotel Hücrelerinin Genel Bölünmesi ve Genişlemesi
- Hücreleri ~ 90-95 birleşim noktasına kadar büyütün. Bu işlem 2-5 gün sürebilir. Bölmek için ortamı çıkarın ve PBS ile durulayın. PBS'yi çıkarın ve minimum hacimde taze 1x tripsin (T25 için 0.5 ml veya T75 için 1.5 ml) ile değiştirin. Tüm yüzeyleri tripsin ile kaplamak için hafifçe döndürün. 37 °C'de ~5 dakika inkübe edin. Düşük güçlü bir ışık mikroskobu kullanarak hücrelerin plakadan ayrılmasını izleyin.
- Hücrelerin çoğu yuvarlatılmış veya ayrılmış göründüğünde, önceden ısıtılmış tam EGM-2 ortamından 5 hacim (yani eklenen tripsin hacmine kıyasla) ekleyin ve tüm hücreleri ayırmak için şişenin yüzeyine hafifçe pipetleyin.
- Endotel hücrelerini 1.6-1.7'de tarif edildiği gibi bir hemositometre ile sayın. Hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin (5 dk, 1.200 x g). Süpernatanı çıkarın. Önceden ısıtılmış tam EGM-2 MV ortamının eklenmesiyle konsantrasyonu ml başına 0,5 milyon hücreye ayarlayın.
- Hücrelerin alikotlarını bakım için uygun FN kaplı kaplara veya şişelere aktarın. Yavaşça döndürün ve inkübatöre yerleştirin. Ortamı kaplamadan sonraki 6-12 saat içinde değiştirin. Medya bundan sonra yaklaşık olarak her 48 saatte bir değiştirilmelidir.
4. Endotel Hücre Transfeksiyonu
NOT: Primer endotel hücreleri, en yaygın kimyasal ve elektroporasyon yöntemleriyle transfeksiyona dirençlidir. Aşağıda açıklanan nükleer transfeksiyon bazlı yöntem, nispeten yüksek transfeksiyon verimliliğine (~%50-70) izin verir. Etkili bir alternatif yöntem, uygun viral vektörlerle enfeksiyonun kullanılmasıdır (Materyal Tablosundaki yorumlara bakınız).
- HLMVEC'lerin veya HDMVEC'lerin T25 veya T75 şişelerini (gerektiği gibi) %90-95'lik bir birleşme nihai yoğunluğuna hazırlayın. Steril koşullarda PBS'de fibronektin (FN) 20ug / ml ile kaplayın, ya Delta-T plakaları gibi mikroskop kültür plakaları (adım 5 için) ya da 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının (adım 6 için) bir kuyucuğuna yerleştirilmiş 12 mm dairesel cam lameller yukarıda açıklandığı gibi (2.1).
- Mikroskop kültür plakalarına 1 ml tam EGM-2 kültür ortamı veya her 24 oyuğa 0,5 ml ekleyin ve plakaları nemlendirilmiş 37 °C /% 5 CO2 inkübatörde dengeleyin.
- Endotel hücrelerini adım 3.1-3.3'teki gibi hasat edin ve sayın. Gerekli hücre hacmini (numune başına 0.5 milyon hücre) RT'de 5 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini numune başına 100 μl RT nükleer transfeksiyon çözeltisinde dikkatlice yeniden süspanse edin.
- 100 μl hücre süspansiyonunu 1-5 μg DNA ile birleştirin. Hücre/DNA süspansiyonunu sertifikalı bir küvete aktarın; Numune, küvetin altını hava kabarcıkları olmadan kaplamalıdır.
NOT: Hücre zarına YFP veya DsRed'i hedefleyen yapılar (posttranslasyonel palmitoilasyon için bir sinyal içeren nöromodülinin N-terminali 20 amino asidi aracılığıyla) tek başına kullanıldı (tek başına membran-YFP veya tek başına membran-DsRed) veya bir sitoplazmik hacimsel işaretleyici ile birlikte transfekte edildi (ör., membran-YFP ve çözünür DsRed). Floresan protein belirteçlerinin birçok permütasyonu kullanılabilir.
- Küveti kapakla kapatın. Hücre/DNA süspansiyonlu küveti elektroporatörün küvet tutucusuna yerleştirin ve elektroporasyon programı S-005'i uygulayın. Program bittiğinde küveti tutucudan çıkarın.
- Küvete ~ 500 μl önceden dengelenmiş kültür ortamı ekleyin ve nükleer transfeksiyon kitinde sağlanan plastik transfer pipetlerini kullanarak hücre süspansiyonunu küvetten nazikçe çıkarın.
- Mikroskop kullanan deneyler için, kültür plakaları, hücre süspansiyonunu bir reaksiyondan önceden ısıtılmış ortam içeren iki tabak arasında eşit olarak bölüştürür (Adım 4.2-4.3). 24 kuyu/plaka kullanan deneyler için, bir reaksiyonu 3 kuyu arasında eşit olarak bölün.
- Hücreleri nemlendirilmiş 37 °C /% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin ve ortamı 4-6 saat ve transfeksiyondan 12-16 saat sonra tekrar değiştirin.
5. Canlı Hücre Görüntüleme ve Analizi
- Endotel Hazırlanması
- Gün 0: Primer HLMVEC'leri membran-YFP ve çözünür DsRed ile adım 4'te tarif edildiği gibi bir nükleofeksiyon teknolojisi ile birlikte transfekte edin ve canlı hücre görüntüleme kültürü plakaları üzerine plakalayın.
- 1. Gün: MHC-II ekspresyonunu indüklemek için ortamı IFN-γ (100 ng / ml) içeren taze ortamla değiştirin. 2. Günde. Mevcut ortama 20 ng / ml TNF-α ilavesiyle transfekte edilmiş hücreleri uyarın.
- 3. Günde, endotelyumu, deneylerden hemen önce 30-60 dakika boyunca 37 ° C'de 1 μg / ml bakteriyel süperantijen stafilokokal enterotoksin B (SEB) ve toksik şok sendromu toksin 1 (TSST) ile inkübe edin. '-Ag' kontrol koşulları için bu adımı atlayın.
- Lenfositlerin Hazırlanması
- Adım 5.1.3'e paralel olarak, 20 mM HEPES, pH 7.4 ve 37 ° C'ye önceden ısıtılmış %0.5 v / v insan serum albümini ile desteklenmiş Tampon A'yı (fenol kırmızısı içermeyen HBSS) hazırlayın. Kültürlenmiş lenfositlerden bir örnek alın ve bir hemositometre ile sayarak yoğunluğu belirleyin (Adım 1.12-1.17).
- 15 ml'lik konik bir tüpte RT'de 5 dakika boyunca 1.200 x g'da numune başına 2 milyon hücreyi santrifüjleyin. Ortamı aspire edin ve hücre peletini 2 ml Tampon A içinde hücre kümesi kalmayacak şekilde nazikçe yeniden süspanse edin.
- Taze bir Fura-2 kalsiyum boyası alikotunu çıkarın ve 1 mM'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için DMSO'da yeniden süspanse edin.
- T hücresi süspansiyonuna (2 μM nihai konsantrasyon) 2 μl Fura-2 stok çözeltisi ekleyin, tüpü kapatın ve boyanın eşit dağılımını sağlamak için tüpü ters çevirerek hemen karıştırın. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Adım 5.2.2'deki gibi santrifüjleyin. Tampon-A'yı aspire edin ve lenfositleri 20-40 μl taze Tampon-A içinde nazikçe ama iyice yeniden süspanse edin.
- Canlı Hücre Görüntüleme Kurulumu ve Edinimi
NOT: Dik ve ters ışık mikroskoplarında canlı hücreli floresan görüntüleme için çok çeşitli sistemler kullanılabilir. Temel gereksinimler arasında bir floresan ışık kaynağı ve filtreler, bir CCD kamera, motorlu filtre değiştirme ve panjurlar, ısıtılmış bir aşama (veya mikroskoba monte edilebilir ısıtmalı oda) ve otomatik görüntü elde etmek için yazılım bulunur. Bu protokol için, gerekli uzamsal çözünürlüğü elde etmek için yüksek sayısal diyafram açıklığı ve yüksek büyütme (yani 40X, 63X) yağa daldırma lensleri gereklidir. Fura-2 bazlı kalsiyum görüntüleme için uygun floresan kaynağı ve lenslerin seçiminde özel dikkat gösterilmelidir, çünkü hepsi gerekli 340/380 nm uyarma dalga boylarıyla uyumlu değildir. Alternatif bir yaklaşım (standart yeşil ve kırmızı floresan filtre setleriyle uyumlu), oransal olmayan kalsiyuma duyarlı boyalarla (örneğin, Fluo-4, Rhod-3) kullanılabilir, ancak bunlar kalsiyum akışını doğru bir şekilde ölçemez ve yalnızca göreceli / kantitatif bir okuma sağlar.
- Mikroskop sistemini açın (çalıştırma için PC, mikroskop, CCD kamera, filtre tekerleği ve ksenon lambası).
- Belirlenen yazılımı açın.
- Otomatik çok kanallı zaman atlamalı görüntüleme için mikroskop/yazılım kurun. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC), standart yeşil floresan, standart kırmızı floresan ve standart 340 ve 380 nm uyarma Fura-2 görüntülerinin sıralı alımını içerir. Çekim aralığını 10-30 saniye ve toplam süre ~20-60 dakika olarak ayarlayın.
- Fura-2 görüntüleme için pozlama sürelerini ayarlayın.
- Taze objektif yağı ekleyin ve sadece 0,5 ml Buffer-A içeren bir mikroskop kabını ısıtma aşaması adaptörüne monte edin ve hemen 37 °C'ye dengelemek için açın (~2-3 dakika sürecektir).
- Dinlenme Fura2 yüklü lenfositleri 20 μl'lik bir pipet kullanarak monte edilmiş mikroskop kabı haznesine ekleyin.
- Parlak alan görüntülemeyi açın. Göz merceklerine giden ışık yolunu seçin. Objektifi mikroskop çanağının alt kısmıyla temas ettirmek için kaba odak düğmesini kullanın. Yemeğin dibine yerleştirilmiş T hücrelerine odaklanmak için göz merceğini ve ince odak düğmesini kullanın.
- En az 10 hücre içeren bir alanı seçmek için x-y aşaması kontrollerini kullanın. Aşırı kalabalık alanlardan ve hücre kümelerinden kaçının çünkü bunlar görüntüleme artefaktları oluşturacaktır.
- Parlak bir alandan floresan ışık kaynağına geçin. Göz merceği görüntülemeden CCD kameraya geçin. Alım parametrelerini ayarlayın (örn. maruz kalma süresi, dedektör kazancı ve gruplama). Yazılımı kullanarak, dinlenme Fura2-340 ve Fura2-380 görüntüleri elde edin (her biri için aynı pozlama süresiyle başlayarak, genellikle ~200-1.000 msn aralığında).
- Her lenfosit için Fura2-340 / Fura2-380'i hesaplamak için Adım 5.4.1'de açıklanan yöntemleri kullanın. Ortalama değerler 1'e yaklaşana kadar Fura2-340 ve Fura2-380 pozlama sürelerini ayarlamak, görüntüleri almak ve oranları hesaplamak için tekrarlanan yinelemeler gerçekleştirin.
- mem-YFP ve DsRed için pozlama sürelerini ayarlayın.
- Adım 5.3.3.1'de kullanılan mikroskop kabını, hücre kültürü inkübatöründen transfekte edilmiş, aktive edilmiş ve SAg ile muamele edilmiş (veya işlenmemiş; kontrol) HLMVEC'ler veya HDMVEC'ler içeren bir mikroskop kabı ile değiştirin (Adım 4.5.1). Ortamı hızlı bir şekilde çıkarmak için tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanın, ~1 ml önceden ısıtılmış Buffer-A ilavesiyle bir kez durulayın. Aspire edin ve ardından 0.5 ml Buffer-A ekleyin.
- Parlak floresan pozitif transfektan endotel hücrelerinin bulunduğu ve iyi şekillendirilmiş hücreler arası bağlantılarla sağlıklı göründüğü alanları tanımlayın.
- Mem-YFP ve DsRed için alım parametrelerini (örn. maruz kalma süresi, dedektör kazancı ve gruplama) ayarlayın. Her kanaldaki ortalama floresan sinyal yoğunluğunun, dedektörün dinamik aralığının %25 ila %75'i arasında olduğundan emin olun.
- Canlı hücre görüntüleme deneyleri yapın.
- Görüntü alımına başlamak için otomatik yazılım kullanın ve bir temel oluşturmak için birkaç görüntü aralığı yakalayın.
- Edinim sırasında, küçük hacimli (P-5 veya P-20) bir pipetin ucunu objektifin merkezine yakın ortama sokarak ve yavaşça çıkararak mikroskop çanağı görüntüleme alanının merkezine ~ 5 μl konsantre Fura-2 yüklü lenfositler (adım 5.2'den itibaren) uygulayın.
- Lenfositler görüntüleme alanına yerleşirken, T hücresi-endotel hücre arayüzünün (immünolojik sinapslar) odak düzleminde tutulmasını sağlamak için odakta ince ayarlamalar yapın. 40 ve 63X hedeflerle, alan başına ~10-20 hücre en uygunudur. Görüntüleme alanında daha az hücre gözlenirse, adım 5.3.4.2'yi tekrarlayın.
- Deneyin istenen gözlem aralığı tamamlandıktan sonra, görüntülemeye devam edin ve maksimum kalsiyum akışı/Fura-2 sinyal sinyalini indüklemek için iyonomisini hemen doğrudan mikroskop kabına (5.3.4.2'deki tekniği kullanarak) 2 μM'lik bir nihai konsantrasyona pipetleyin (yani, bir kalibrasyon aracı, Bkz. analiz 5.4.).