$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Meme kanseri gelişiminin transgenik fare modeli
- Devam etmeden önce palpasyon veya kaliper ölçümü ile uygun tümör büyümesi için istenen kanser modelinden fareleri gözlemleyin.
not: Burada, meme kanseri gelişiminin transgenik murin modeli (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) kullanıldı. Bu hayvanlar, her meme bezinde 6 ila 12 haftalıkken kendiliğinden invaziv meme karsinomları geliştirir. Normal meme bezleri, transgen negatif, yaş uyumlu yavrulardan kontrol olarak kullanıldı.
>2. Spesifik ve spesifik olmayan antikor ajanlarının intravenöz enjeksiyonu
- Üretici talimatlarına göre koruyucuları ve depolama tamponlarını çıkarmak için tavşan anti-fare B7-H3 ve tavşan immünoglobulin G (IgG) izotip kontrol antikorlarını bir tuzdan arındırma kolonunda (örn., PD-10) saflaştırın.
not: Bazı antikorlar, Protein-A agaroz boncuk bazlı protokol ile daha fazla saflaştırmaya ihtiyaç duyabilir.
- Ayrı mikrosantrifüj tüplerinde her bir antikor konjugatının 33 μg'lık alikot dozajları.
not: Uygulanan ajanın dozu, uygulamaya bağlı olarak değişebilir ve antikor konjugatının rutin olarak kullanıldığı dozajlarla eşleşir. Hayvan güvenliği için hacim 100 μL'den fazlaysa antikor çözeltilerinin konsantrasyonu gereklidir.
- Doku alımından önce istenen zaman noktasında, burada 96 saat, tümör taşıyan hayvanı 2 L / dk'da oksijen içinde akan %2 izofluran ile anestezi yapın ve 37 ° C'lik ısıtılmış bir aşamaya yerleştirin. İşlemden önce uygun anestezi seviyesine ulaşıldığından emin olmak için ayak parmağınızı sıkıştırın.
- Antikor çözeltilerinin kuyruk damarı aşılamasına hazırlanmak için, hayvanın kuyruğunu alkollü bir mendille üç kez silerek dezenfekte edin. Kuyruk damarlarını yaklaşık 30 saniye boyunca bir ısı yastığı ile ısıtarak genişletin. Tüm hayvanı ısıtmaktan kaçının. Isı yastığını çıkardıktan sonra kuyruğu bir kez daha alkollü mendille silin.
- 27G'lik bir kuyruk damarı kateteri kullanarak, kelebek iğneyi iki yan kuyruk damarından birine yerleştirin ve takılan iğne ile kuyruğu bir parça cerrahi bantla sahneye dikkatlice sabitleyin.
not: Katetere görünür kan geri akışı, iğnenin kuyruk damarı içindeki uygun yerini gösterir.
- Kateteri 25 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın, ardından antikor solüsyonunu insülin şırıngaları kullanarak katetere enjekte edin. Kateteri bir kez daha 25 μL steril PBS ile yıkayın.
- İğneyi kuyruktan çıkarın ve herhangi bir kanamayı durdurmak için baskı uygulayın.
- Anesteziyi kapatın ve herhangi bir sıkıntı belirtisi için tamamen uyanana kadar hayvanı gözlemleyin.
3. Hedef tümör dokularının toplanması ve hazırlanması
- İstenilen zaman noktasında, hayvanı kabul edilebilir kurumsal prosedüre göre insancıl bir şekilde ötenazi yapın, burada, %100 hacim / dak oda deplasmanlı akış hızına sahip bir sıkıştırılmış gaz tankından %2 10-30 CO30 soluyarak
not: IVIL tekniğinin bazı uygulamaları, serbestçe dolaşan antikorları uzaklaştırmak için PBS ile kardiyak perfüzyon yoluyla ötenazi gerektirir.
- Solunum ve kalp hareketinin kesilmesi, ayak parmağı sıkışma tepkisinin olmaması ve mukoza zarının grileşmesi yoluyla insancıl ötenazinin doğrulanmasından sonra, cerrahi makas ve forseps kullanarak tümör dokularını aşağıdaki gibi eksize edin:
- Fareyi sırtüstü pozisyonda yatırın ve forseps ile kuyruğa en yakın meme bezleri seti (5.) arasında sadece dış deri tabakasını kavrayın, bir çift cerrahi makasla küçük bir kesi yapın.
- Kapalı makası kesiğe sokun ve cildi alttaki karın duvarı zarından dikkatlice ayırmak için ucu yavaşça açın ve sağlam kalmasını sağlayın.
- Cildi iç zardan ayırmaya devam ederek karın boyunca dikey bir kesi yapın. 3. ve 4. meme bezleri arasında, cildin geri çekilmesine ve meme bezlerinin görüntülenmesine izin vermek için karın boyunca yatay bir kesi yapın.
not: Meme tümörleri ve bezleri yüzeysel olarak cilt altında yer alır.
- Her bir tümörü veya normal bezi forseps ile kavrayarak, bağlı cildi cerrahi makas kullanarak dikkatlice kesin.
- Eksize edilen dokuları, önceden etiketlenmiş ve optimum kesme sıcaklığı (OCT) gömme ortamı ile doldurulmuş tek kullanımlık doku taban kalıplarına yerleştirin ve kalıpları kuru buz üzerine yerleştirerek hızlı bir şekilde dondurun. Hedef dışı doğumu incelemek için, ilgilenilen diğer dokuları veya organları (örneğin, karaciğer veya akciğerler) çıkarın.
not: Bu noktada protokolü duraklatmak için, donmuş doku bloklarını devam etmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
- Bir kriyostat kullanarak, donmuş doku bloklarını 10 μm kalınlığında bölümlere ayırın ve bitişik bölümleri önceden etiketlenmiş yapışma cam slaytlarına yerleştirin.
not: Bu noktada protokolü duraklatmak için, devam etmeye hazır olana kadar slaytları -80 °C'de saklayın.
4. Ex vivo boyama protokolü
NOT: Floresan mikroskobu görüntüleri arasındaki kantitatif karşılaştırma için, tüm slaytlar aynı anda aynı hazırlanmış solüsyonlarla boyanır.
- OCT'yi çıkarmak için donmuş doku slaytlarını oda sıcaklığında PBS ile 5 dakika durulayın.
- Boyama sırasında ihtiyaç duyulan çözeltilerin hacmini azaltmak için doku kesitlerini hidrofobik bir bariyer kalemle ayırın.
not: Kalemin doku örneklerinin üzerinden geçmesine izin vermemeye dikkat edin, çünkü bu, dokuyu slayttan çıkarabilir veya etkilenen doku kısmında uygun lekelenmeyi önleyebilir. Doku bölümlerinin herhangi bir noktada susuz kalmasına izin vermeyin.
- Doku bölümlerini 5 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisi ile sabitleyin.
- Slaytları PBS'de 5 dakika durulayın.
- PBS'de %0.5 Triton-X 100 ile doku kesitlerini 15 dakika boyunca geçirgenleştirin.
- Slaytları PBS'de 5 dakika durulayın.
- Dokuları% 3 w / v sığır serum albümini (BSA) ve% 5 v / v keçi serumu ile, her ikisi de oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS (bloke etme çözeltisi) içinde bloke edin.
not: Bloke edici solüsyon serumunu ikincil antikor konakçı hayvanla eşleştirin.
- Slaytları PBS'de 5 dakika durulayın.
- Bölümleri istenildiği gibi kayıt tutan birincil antikorlarla, muhtemelen ortak bir nükleer (örneğin, DAPI), vasküler (örneğin, CD31) veya sitoplazmik işaretleyici (örneğin, aktin) ile inkübe edin. Burada, 1:100 seyreltmede sıçan anti-fare CD31 (vasküler belirteç), üreticinin talimatlarına göre, bir slayt tepsisi üzerinde dehidrasyondan korunarak gece boyunca 4 ° C'de bloke etme solüsyonunda kullanıldı.
not: Ek primer antikor veya antikor konjugatı eklemeyin. Enjekte edilen ve in vivo olarak dokularda birikmesine izin verilen konjugat, birincil antikor görevi görür.
- Slaytları PBS'de 5 dakika boyunca üç kez durulayın ve her seferinde PBS'yi değiştirin.
- Birincil antikorları etiketlemek için slaytları ikincil antikorlarla inkübe edin. Bu uygulama için, AlexaFluor-546 konjuge keçi tavşan antikoru (1:200 seyreltme, üreticinin talimatlarına göre optimize edilmiş) ve AlexaFluor-488 keçi anti-sıçan ikincil antikoru (1:200 seyreltme, üreticinin talimatlarına göre optimize edilmiş) ile CD31 kullanarak anti-B7-H3 antikorunu görselleştirin, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir slayt tepsisi üzerinde ışıktan ve dehidrasyondan korunan bloke edici çözeltide.
not: İkincil antikorlar aynı konakçı hayvandandır, ancak ikincil antikorların ilgili primer antikorun konakçı türüne olan afinitesiyle eşleşir. Kaydıraklar bu noktadan itibaren ışıktan korunur.
- Slaytları PBS'de 5 dakika boyunca üç kez durulayın ve her seferinde PBS'yi değiştirin.
- Montaj ortamının bir damlasını doku diliminin ortasına uygulayın ve hava kabarcıklarının sıkışmasını önleyerek dikkatlice bir lamel yerleştirin.
- Lamelin kenarlarını şeffaf oje ile kapatın ve kurumasını bekleyin.
not: Bu noktada protokolü bir haftaya kadar duraklatmak için, devam etmeye hazır olana kadar slaytları -20 °C'de saklayın.
5. Konfokal mikroskopi görüntüleme ve kantitatif görüntü analizi
>NOT: Konfokal mikroskop ve görüntüleme parametrelerinin hazırlanması, kullanılan konfokal sisteme bağlı olacaktır. Burada kullanılan mikroskop ticari olarak satın alındı (örneğin, Zeiss LSM 510 Meta sistemi) ve ilgili edinim yazılımı kullanıldı (örneğin, Zen 2009). Bununla birlikte, bu adımların çoğu herhangi bir konfokal mikroskop için geçerli olacak ve temel konfokal mikroskopi bilgisini varsayacaktır.
- Sistem açıldıktan ve ısındıktan sonra, istenen hedefi seçin; burada 20x (sayısal açıklık = 0.8) bir hedef kullanıldı.
- En parlak sinyal için optimizasyonun ayarlanmasına izin vermek için pozitif bir kontrol sürgüsü yükleyin, lamel aşağı inin. Kırmızı kanalda görüntüleme, Canlı görüntüleme modunda sistemi örneğe odaklayın.
- Kullanılan her lazer kanalı için lazer yoğunluğunu, ana kazancı ve iğne deliği boyutunu aşağıdaki gibi optimize edin:
- Görüntüleme için Sürekli moda geçin.
- Arama Tablosu (LUT) histogramını izlerken Lazer Yoğunluğu (lazer gücünü kontrol eder) ve Kazanç (Master) (fotoçoğaltıcı tüpün voltajını kontrol eder) kaydırma çubuklarını optimize edin. Histogramın dinamik aralığı pikselleri doygunlaştırmadan dolana kadar bu iki ayarı yapın.
not: Lazer yoğunluğu çok yüksekse, foto ağartma meydana gelir. Kazanç (Master) çok yüksekse, görüntü gürültülü hale gelir. İdeal olarak, Kazanç (Master) aralığının ortasında olacaktır.
- İğne deliğini, en yüksek çözünürlüğü ve en ince z dilimini veren 1 havadar birime (AU) ayarlayın.
- Gerçek bir siyah arka plan için LUT histogramındaki parazit tabanını en aza indirmek için Dijital Ofset çubuğunu kaydırın.
not: Mikroskopi ayarları her lazer kanalı ve objektif için optimize edildikten sonra, slaytlar arasında kantitatif karşılaştırmaya izin vermek için bunları görüntüleme oturumu boyunca ve tüm slaytların görüntülenmesi için sabit tutun.
- Alım Modu sekmesi altında, Ortalama altında, istediğiniz Sayı ve Bit Derinliği'ni seçin. En uygun piksel boyutunu ayarlamak için En uygun düğmesine tıklayın.
- Yüksek kaliteli bir görüntü toplamak için Snap edinme düğmesini kullanın. Burada, tümör içinden rastgele görüş alanları seçildi, ancak farklı uygulamalar için başka ilgi alanları da geçerli olabilir (damarlar, tümör sınırları, penetrasyon derinliği vb.)
- Görüntü dosyalarını, çevrimdışı işleme ve niceleme için konfokal yazılım tarafından kullanılan formatta (burada, ".lsm") kaydedin.
not: Aynı oturum sırasında tüm slaytlar görüntülenmiyorsa, ayarları kaydedin ve sonraki ziyaretlerde yeniden yükleyin, ancak foto ağartma nedeniyle aynı slaytı yeniden görüntülemeniz önerilmez.
- Kantitatif floresan yoğunluğu ölçümlerini gerçekleştirin. Fiji'yi açın (Fiji Is Just ImageJ yazılımı) ve durum çubuğuna sürükleyerek bir .lsm görüntü dosyası yükleyin.
- Renk kanalı verilerini bölün. Görüntü > Yığınları > Bölünmüş Kanallar'a gidin.
- Floresan görüntüleri gerektiği gibi önceden işleyin, yani arka plan sinyalini çıkarın (İşlem > Arka Planı Çıkar) veya bir filtreleme yöntemiyle gürültüyü azaltın.
- Sinyal yoğunluğunda bir eşik ayarlayarak referans proteine (vasküler, nükleer, hücresel leke) karşılık gelen renk kanalını segmentlere ayırın (Resim > Eşiği > Ayarlayın).
not: Manuel eşikleme, görüntü analizine öznellik getirir, bu nedenle, otomatik bir eşikleme algoritması kullanmak veya görüntü histogramlarına atıfta bulunmak, görüntü analizi sonuçlarını daha az önyargılı hale getirir.
- İkili maske oluşturmak için bu eşiği kullanın (İşlem > İkili > Maskeye Dönüştür).
- Maske içindeki yatırım getirilerini ölçün ve etiketleyin (Parçacıkları Analiz Et > Analiz Et > Yöneticiye Ekle > Tamam'ı işaretleyin).
- ROI'leri ilgilenilen antikora karşılık gelen renk kanalına uygulayın (Kanal görüntüsünü tıklayın, Analiz > Araçları > ROI Yöneticisi > Ölçün). Bu, maske ROI'lerini antikor görüntüsüne uygulayacak ve Sonuçlar penceresindeki etiket bölümleri için görüntü ölçümleri sağlayacaktır. Sonuçları kaydet penceresi (Dosya > Kaydet).
- Burada açıklandığı gibi ortalama floresan yoğunluğu gibi istenen ilgilenilen istatistiği hesaplayın.
- Tüm işleme adımlarını, bir slayt kümesindeki her görüntü için aynı şekilde gerçekleştirin. Büyük görüntü toplu işlemleri için bunu otomatik olarak yapmak üzere bir makro oluşturun.
- Yalnızca nicel ölçümlerden sonra görüntü görüntüleme için, minimum, maksimum, parlaklık ve kontrastı tüm slaytlarda aynı seviyelere ayarlayarak biyodağılım modellerinin görselleştirilmesini optimize etmek için nitel görüntü ayarlamaları uygulayın (Resim > Parlaklık/Kontrast > Ayarlayın).
- Görüntü türünü (Görüntü > Türü > RGB Renk) dönüştürün ve dosyaları sunumlarda ve yayınlarda kullanmak için .tiff (Dosya > Farklı Kaydet > Tiff...) gibi kayıpsız bir görüntü türünde kaydedin.