Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tükürükteki patojene özgü antikorları tanımlamak için boncuk bazlı bir multipleks immünolojik test

1K görüntülenme

⸱

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

Kaynak: Augustine, S. A. J., et al. İnsanların Çevresel Patojenlere Maruziyetini Ölçmek için Tükürük Antikoru Multipleks İmmünoassay Geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, insan tükürüğündeki birden fazla çevresel patojen için antikorları aynı anda tespit etmek için boncuk tabanlı bir multipleks immünoassay tekniğini göstermektedir. Floresan boncuklar, insan tükürük örneğindeki antikorlar kullanılarak yakalanan farklı patojenlerden gelen antijenlere bağlandı. Antikorlar bir floresan raportör kullanılarak etiketlendikten sonra, boncuklar tükürükte farklı patojene özgü antikorların varlığını değerlendirmek için akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi.

Protokol

>1. Boncuk Bağlantısı

  1. Tablo 1'de gösterilen konsantrasyonları kullanarak antijenleri boncuk setlerine bağlayın.
  2. Her bir antijeni aktive edilmiş boncuklara ekleyin ve toplam hacmi 50 mM MES, pH 5.0'da 500 μl'ye getirin. Antijenleri ve boncukları girdapla karıştırın.
  3. Antijenleri ve boncukları karanlıkta oda sıcaklığında dönerek (~ 15 rpm) karıştırarak 2 saat inkübe edin. Birleştirilmiş boncukları 2 dakika boyunca 10.000 x g'da mikrosantrifüjleme ile peletleyin.
  4. Süpernatanı çıkarın ve boncukları 500 μl fosfat tamponlu salin (PBS) -sığır serum albümini (BSA) -polioksietilen sorbitan monolaurat (Twe....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman ve Yazılım
MikrosantrifüjTermo Elektron Şirketi75002446Numuneleri santrifüjlemek için kullanılır
Vorteks KarıştırıcıVWR (VWR)G560Örnekleri karıştırmak için kullanılır
Sonikatör (mini)Balıkçı Bilimsel15-337-22Boncukları ayırmak için kullanılır
Pipetleyiciler P10, P20, P100, P1000, 8 kanal.Cappçeşitli
Çok Ekranlı Vakum ManifolduKırlangıçMSVMHTS00Süpernatanı çıkarmak için yıkama adımlarında kullanılır
Mikro ÇalkalayıcıVWR (VWR)12620-926İnkübasyonlar sırasında boncukları çalkalamak için kullanılır
Tüp rafı (1,5 mL ve 0,5 mL) (çeşitli)VWR (VWR)30128-346
Tartı KantarıMettler veya diğerTampon yapmak için yıkama reaktiflerini ölçmek için kullanılır
Dynabead Numune MikseriCanlandırıcı947-01Kaplin inkübasyon adımı sırasında kullanılır
MatLab (R2014b)MathWorks, Inc.Antikor yanıt verilerini analiz etmek için kullanılır
Microsoft Excel 2014Microsoft ŞirketiAntikor yanıt verilerini analiz etmek için kullanılır
xPonent 3.1 yazılımına sahip Luminex AnalizörüLuminex ŞirketiLX200-XPON3.1Tahlili çalıştırmak için kullanılan cihaz ve yazılım
Antijen
GI.1 Norwalk Virüsü : p-partikülüXi Jiang (CCHMC)*Na*Cincinnati Çocuk Hastanesi. Son sonuç 5 μg.
GII.4 Norovirüs VA387 : p-parçacığıXi Jiang (CCHMC)*Na*Cincinnati Çocuk Hastanesi. Son sonuç 5 μg.
Hepatit A Virüsü: hücre kültüründen derece II konsantreMeridyen Yaşam Bilimleri8505100 μg'da birleştirilmiş antijen
Helicobacter pylori : lizatMeridyen Yaşam BilimleriR1410125 μg'da birleştirilmiş antijen
Toxoplasma gondii : rekombinant p30 (SAG1)Meridyen Yaşam BilimleriR1842625 μg'da birleştirilmiş antijen
Campylobacter jejuni : ısı bütün hücreleri öldürdüKPL (Türkçe)50-92-9350 μg'da birleştirilmiş antijen
Birincil Antikorlar
Gine domuzu anti-Norovirüs(CCHMC)*NaKaplin onayı için kullanılır
Fare anti-Hepatit A IgGMeridyen Yaşam BilimleriC65885MKaplin onayı için kullanılır
Fare anti-Hepatit A IgGMeridyen Yaşam BilimleriC65885MKaplin onayı için kullanılır
Helicobacter pylori'ye karşı BacTraceAffinity Saflaştırılmış AntikorKPL (Türkçe)01-93-94Kaplin onayı için kullanılır
Toxoplasma gondii'ye keçi pAbAbcam BelediyesiAB23507Kaplin onayı için kullanılır
BacTrace Keçi anti-Campylobacter türleriKPL (Türkçe)01-92-93Kaplin onayı için kullanılır
İkincil Antikorlar
Biotin-SP-Konjuge AffiniPure Eşek Anti-Keçi IgG (H + L)Jackson705-065-149Kaplin onayı için kullanılır
Biyotinile Tavşan Anti-Keçi IgG (H + L)KPL (Türkçe)16-13-06Kaplin onayı için kullanılır
Biyotinile Keçi Anti-Fare IgG (H + L)KPL (Türkçe)16-18-06Kaplin onayı için kullanılır
Afinite Saflaştırılmış Antikor Biotin Etiketli Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)KPL (Türkçe)176-1506Kaplin onayı için kullanılır
Afinite Saflaştırılmış Antikor Biyotin Etiketli Keçi Anti-İnsan IgG (γ)KPL (Türkçe)16-10-02Tükürük İmmünoassay için kullanılır
Sarf
1.5 mL kopolimer mikrosantrifüj tüpleriABD Bilimsel1415-2500Düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri olarak kullanılır
10 μL pipet ucu yedekleriBiyolojik Girişimler5030050C
200 μL pipet ucu yedekleriBiyolojik Girişimler5030080C
1000 μL pipet ucu yedekleriBiyolojik Girişimler5130140C
Alüminyum folyoÇeşitli SatıcılarKuluçka sırasında boncukları karanlıkta tutmak için kullanılır
Derin Kuyu plakalarıVWR (VWR)40002-009Tükürük örneklerini seyreltmek için kullanılır
Çok Ekranlı Filtre PlakalarıKırlangıçMABVN1250Tahlilleri çalıştırmak için kullanılır
Oracol tükürük toplama sistemiMalvern Tıbbi Gelişmeler Limited ŞirketiTükürük toplama için kullanılır
Reaktif
Karboksilatlı mikro küreler (boncuklar)Luminex ŞirketiBoncuk setine bağlıdırAntijenler mikrokürelere bağlanır
EDC (1-etil-3- [3dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür)delmek77149 veya 22980Boncuk aktivasyonunda kullanılır
Sülfo-NHS (N-hidroksisülfosüksinimid)delmek24510Boncuk aktivasyonunda kullanılır
Steptavidin-R-fikoeritrin (1mg / mL)Moleküler ProblarS-866 SerisiMuhabir olarak kullanılır
MES (2- [N-Morfolino] etansülfonik asit)SigmaM-2933Kaplin için kullanılır
Ara-20 (Polioksietilenorbitan monolaurat)SigmaP-9416Spesifik olmayan bağlanmayı gidermek için yıkama tamponunda kullanılır
Protein Tamponları
PBS-TBN Engelleme/Depolama Tamponu (PBS, %0,1 BSA, %0,02 Ara-20, %0,05 Azide, pH 7,4)**Filtre: Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın
PBS, pH 7.4SigmaP-3813 Serisi138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BsaSigmaA-7888%0,1 (a/h)
Ara-20SigmaP-9416%0,2 (h/h)
Sodyum Azid (%0,05 azid)**SigmaS-8032 Serisi** Dikkat: Sodyum azid akut toksiktir. Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Uygun KKD'ler giyin. Yürürlükteki yasalara göre imha edin.
MES/ Birleştirme Tamponu (0,05 m MES, pH 5,0)
MES (2- [N-Morfolino] etansülfonik asit)SigmaS-3139 Serisi
5 N NaOHbalıkçıSS256-500
Tahlil Tamponu (PBS, %1 BSA, pH 7.4)Filtre: Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın
PBS, %1 BSA, pH 7.4SigmaP-3688 Serisi138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, %1 BSA
Aktivasyon Tamponu (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)Filtre: Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın
NaH2PO4 (Sodyum fosfat, monobazik susuz)SigmaS-3139 Serisi0.1M NaH2PO4
5 N NaOHbalıkçıSS256-500
Yıkama Tamponu (PBS, %0,05 Ara-20, pH 7,4)Filtre: Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın
PBS, %0.05 Ara-20, pH 7.4SigmaP-3563 Serisi138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, %0.05 TWEEN
Serisi Serisi Serisi Serisi arası Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi

Daha fazla makale keşfet

Tükürük Antikor TespitiAkış Sitometrisi AnaliziFloresan Boncuk BağlamaAntijen-Antikor BağlanmasıBiyotinlenmiş İkincil AntikorlarStreptavidin Raporlayıcı BoyaMikroküre Floresans TespitiÇevresel Patojen Maruziyeti