Tükürükteki patojene özgü antikorları tanımlamak için boncuk bazlı bir multipleks immünolojik test

Abstract

Kaynak: Augustine, S. A. J., et al. İnsanların Çevresel Patojenlere Maruziyetini Ölçmek için Tükürük Antikoru Multipleks İmmünoassay Geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, insan tükürüğündeki birden fazla çevresel patojen için antikorları aynı anda tespit etmek için boncuk tabanlı bir multipleks immünoassay tekniğini göstermektedir. Floresan boncuklar, insan tükürük örneğindeki antikorlar kullanılarak yakalanan farklı patojenlerden gelen antijenlere bağlandı. Antikorlar bir floresan raportör kullanılarak etiketlendikten sonra, boncuklar tükürükte farklı patojene özgü antikorların varlığını değerlendirmek için akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi.

Protocol

>1. Boncuk Bağlantısı

1. Tablo 1'de gösterilen konsantrasyonları kullanarak antijenleri boncuk setlerine bağlayın.
2. Her bir antijeni aktive edilmiş boncuklara ekleyin ve toplam hacmi 50 mM MES, pH 5.0'da 500 μl'ye getirin. Antijenleri ve boncukları girdapla karıştırın.
3. Antijenleri ve boncukları karanlıkta oda sıcaklığında dönerek (~ 15 rpm) karıştırarak 2 saat inkübe edin. Birleştirilmiş boncukları 2 dakika boyunca 10.000 x g'da mikrosantrifüjleme ile peletleyin.
4. Süpernatanı çıkarın ve boncukları 500 μl fosfat tamponlu salin (PBS) -sığır serum albümini (BSA) -polioksietilen sorbitan monolaurat (Tween-20) -sodyum azid (PBS-TBN) pH 7.4'te girdap ve sonikasyon ile yeniden süspanse edin. Boncukları 2 dakika boyunca 10.000 x g'da mikrosantrifüjleme ile pellet yapın ve süpernatantı çıkarın.
   Dikkat: Sodyum azid, akut toksik bir kimyasaldır. Yutulması veya cilt ile temas etmesi halinde ölümcüldür. Toz/duman/gaz/sis/buhar veya spreyi solumayın. Uygun yasalara uygun olarak tutarken ve atarken uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD'ler) kullanın.
5. Boncukları 1 ml PBS-TBN'de girdap ve 20 saniye boyunca sonikasyon ile yeniden süspanse edin.
6. Boncukları 2 dakika boyunca 10.000 x g'da mikrosantrifüjleme ile peletleyin.
7. 1.5 ve 1.6.
   adımlarını tekrarlayın not: Bu, PBS-TBN ile toplam iki yıkama sağlar.
8. Birleştirilmiş ve yıkanmış boncukları 1 ml PBS,% 1 BSA,% 0.05 Azide, pH 7.4 içinde yeniden süspanse edin. Birleştirilmiş boncukları karanlıkta 2-8 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.

2. Tükürük Multipleks İmmünoassay

1. Tükürüğü -80 °C dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözülmesine izin verin.
2. Antijene bağlı boncuk stoklarını 20 saniye boyunca girdap ve sonikasyon ile yeniden askıya alın.
3. Birleştirilmiş boncuk stoklarını, PBS-1% BSA tamponunda her bir benzersiz boncuk setinden 100 boncuk / μl'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek çalışan bir boncuk karışımı hazırlayın.
4. 96 oyuklu, derin kuyulu bir plakada PBS-1% BSA tamponu ile 1: 4 oranında tükürük seyreltmesi hazırlayın.
5. Filtre plakasını 100 μl yıkama tamponu ile önceden ıslatın ve süpernatanı vakumla çıkarın.
6. 1:8 nihai seyreltme için 96 oyuklu filtre plakasının 95 kuyusuna 50 μl çalışan boncuk karışımı ve eşit hacimde seyreltilmiş tükürük ekleyin. Reaksiyonları çok kanallı bir pipetleyici ile karıştırın. Bir kontrol kuyusuna 50 μl antijene bağlı boncuklar artı 50 μl PBS-1% BSA tamponu (tükürük yerine olarak) ekleyin.
7. Örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında 500 rpm'de bir mikroplaka çalkalayıcı üzerinde 1 saat inkübe etmeye bırakın. Süpernatanı vakumla çıkarın. Kuyuları 100 μl yıkama tamponu ile yıkayın ve süpernatanı vakumla çıkarın. 1 kez yıkamayı tekrarlayın.
8. Boncukları çok kanallı bir pipetleyici ile 50 μl PBS-1% BSA'da yeniden süspanse edin.
9. Biyotinile keçi anti-insan IgG ikincil tespit antikorunu PBS-1% BSA'da 16 μg / ml'ye seyreltin.
10. Her oyuğa 50 μl seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve içeriği çok kanallı bir pipetleyici ile karıştırın.
11. Filtre plakasını örtün ve bir plaka çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika karanlıkta inkübe etmesine izin verin. Süpernatanı vakumla çıkarın. Kuyuları 100 μl yıkama tamponu ile yıkayın ve süpernatanı vakumla çıkarın. 1 kez yıkamayı tekrarlayın.
12. Boncukları çok kanallı bir pipetleyici ile 50 μl PBS-1% BSA'da yeniden süspanse edin.
13. Streptavidin-R-fikoeritrin raportörünü (SAPE) PBS-1% BSA'da 24 μg / ml'ye seyreltin.
14. Her kuyucuğa 50 μl raportör ekleyin ve çok kanallı bir pipetleyici ile karıştırın.
15. Filtre plakasını örtün ve bir plaka çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika karanlıkta inkübe etmesine izin verin. Süpernatanı vakumla çıkarın. Kuyuları 100 μl yıkama tamponu ile yıkayın ve süpernatanı vakumla çıkarın. 1 kez yıkamayı tekrarlayın.
16. Boncukları 100 μl PBS-1% BSA'da yeniden süspanse edin ve analizörü kullanarak 50 μl'yi analiz edin.
    not: Multipleks immünolojik testin sonuçları Medyan Floresan Yoğunluğu (MFI) birimlerinde ölçülür. Hataları önlemek için her zaman yazılım kılavuzunun en son sürümüne bakın.

Tablo 1: Multipleks immünolojik test için çalışan boncuk karışımı.Birleştirme ve onaylama tamamlandıktan sonra, gösterildiği gibi her bir boncuk setinden oluşan bir ana karışım hazırlandı. Ana karışım, 96 oyuklu plakadaki tüm kuyucuklar arasında dağıtıldı. Tüm kuyucuklar, sadece boncuklar ve PBS-1% BSA tamponu içeren bir arka plan kontrol kuyusu dışında tükürük ile inkübe edildi.

için

Antijen	Boncuk Seti	Kaplin tamponu	Ag Konsantrasyonu (μg)	1 köşede # boncuk	# boncuk/μl	Hacim 100 B/uL için 4 ml (μl)
C. jejuni	8	MES 5.0	50	64	6.400	94
H. pylori	33	MES 5.0	25	71	7.100	85
Hepatit A	42	MES 5.0	100	91	9.100	66
T. gondii	30	MES 5.0	25	85	8.500	71
Norovirüs GII.4	55	MES 5.0	5	72	7.200	83
Norovirüs GI.1	67	MES 5.0	5	63	6.300	95
Bağlantısız	80	MES 5.0		60	6.000	100
		Toplam boncuk hacmi (μl)				594
		Toplam gereken tampon hacmi (μl)				3.406

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ekipman ve Yazılım
Mikrosantrifüj	Termo Elektron Şirketi	75002446	Numuneleri santrifüjlemek için kullanılır
Vorteks Karıştırıcı	VWR (VWR)	G560	Örnekleri karıştırmak için kullanılır
Sonikatör (mini)	Balıkçı Bilimsel	15-337-22	Boncukları ayırmak için kullanılır
Pipetleyiciler P10, P20, P100, P1000, 8 kanal.	Capp	çeşitli
Çok Ekranlı Vakum Manifoldu	Kırlangıç	MSVMHTS00	Süpernatanı çıkarmak için yıkama adımlarında kullanılır
Mikro Çalkalayıcı	VWR (VWR)	12620-926	İnkübasyonlar sırasında boncukları çalkalamak için kullanılır
Tüp rafı (1,5 mL ve 0,5 mL) (çeşitli)	VWR (VWR)	30128-346
Tartı Kantarı	Mettler veya diğer		Tampon yapmak için yıkama reaktiflerini ölçmek için kullanılır
Dynabead Numune Mikseri	Canlandırıcı	947-01	Kaplin inkübasyon adımı sırasında kullanılır
MatLab (R2014b)	MathWorks, Inc.		Antikor yanıt verilerini analiz etmek için kullanılır
Microsoft Excel 2014	Microsoft Şirketi		Antikor yanıt verilerini analiz etmek için kullanılır
xPonent 3.1 yazılımına sahip Luminex Analizörü	Luminex Şirketi	LX200-XPON3.1	Tahlili çalıştırmak için kullanılan cihaz ve yazılım
Antijen
GI.1 Norwalk Virüsü : p-partikülü	Xi Jiang (CCHMC)*	Na	*Cincinnati Çocuk Hastanesi. Son sonuç 5 μg.
GII.4 Norovirüs VA387 : p-parçacığı	Xi Jiang (CCHMC)*	Na	*Cincinnati Çocuk Hastanesi. Son sonuç 5 μg.
Hepatit A Virüsü: hücre kültüründen derece II konsantre	Meridyen Yaşam Bilimleri	8505	100 μg'da birleştirilmiş antijen
Helicobacter pylori : lizat	Meridyen Yaşam Bilimleri	R14101	25 μg'da birleştirilmiş antijen
Toxoplasma gondii : rekombinant p30 (SAG1)	Meridyen Yaşam Bilimleri	R18426	25 μg'da birleştirilmiş antijen
Campylobacter jejuni : ısı bütün hücreleri öldürdü	KPL (Türkçe)	50-92-93	50 μg'da birleştirilmiş antijen
Birincil Antikorlar
Gine domuzu anti-Norovirüs	(CCHMC)*	Na	Kaplin onayı için kullanılır
Fare anti-Hepatit A IgG	Meridyen Yaşam Bilimleri	C65885M	Kaplin onayı için kullanılır
Fare anti-Hepatit A IgG	Meridyen Yaşam Bilimleri	C65885M	Kaplin onayı için kullanılır
Helicobacter pylori'ye karşı BacTraceAffinity Saflaştırılmış Antikor	KPL (Türkçe)	01-93-94	Kaplin onayı için kullanılır
Toxoplasma gondii'ye keçi pAb	Abcam Belediyesi	AB23507	Kaplin onayı için kullanılır
BacTrace Keçi anti-Campylobacter türleri	KPL (Türkçe)	01-92-93	Kaplin onayı için kullanılır
İkincil Antikorlar
Biotin-SP-Konjuge AffiniPure Eşek Anti-Keçi IgG (H + L)	Jackson	705-065-149	Kaplin onayı için kullanılır
Biyotinile Tavşan Anti-Keçi IgG (H + L)	KPL (Türkçe)	16-13-06	Kaplin onayı için kullanılır
Biyotinile Keçi Anti-Fare IgG (H + L)	KPL (Türkçe)	16-18-06	Kaplin onayı için kullanılır
Afinite Saflaştırılmış Antikor Biotin Etiketli Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)	KPL (Türkçe)	176-1506	Kaplin onayı için kullanılır
Afinite Saflaştırılmış Antikor Biyotin Etiketli Keçi Anti-İnsan IgG (γ)	KPL (Türkçe)	16-10-02	Tükürük İmmünoassay için kullanılır
Sarf
1.5 mL kopolimer mikrosantrifüj tüpleri	ABD Bilimsel	1415-2500	Düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri olarak kullanılır
10 μL pipet ucu yedekleri	Biyolojik Girişimler	5030050C
200 μL pipet ucu yedekleri	Biyolojik Girişimler	5030080C
1000 μL pipet ucu yedekleri	Biyolojik Girişimler	5130140C
Alüminyum folyo	Çeşitli Satıcılar		Kuluçka sırasında boncukları karanlıkta tutmak için kullanılır
Derin Kuyu plakaları	VWR (VWR)	40002-009	Tükürük örneklerini seyreltmek için kullanılır
Çok Ekranlı Filtre Plakaları	Kırlangıç	MABVN1250	Tahlilleri çalıştırmak için kullanılır
Oracol tükürük toplama sistemi	Malvern Tıbbi Gelişmeler Limited Şirketi		Tükürük toplama için kullanılır
Reaktif
Karboksilatlı mikro küreler (boncuklar)	Luminex Şirketi	Boncuk setine bağlıdır	Antijenler mikrokürelere bağlanır
EDC (1-etil-3- [3dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür)	delmek	77149 veya 22980	Boncuk aktivasyonunda kullanılır
Sülfo-NHS (N-hidroksisülfosüksinimid)	delmek	24510	Boncuk aktivasyonunda kullanılır
Steptavidin-R-fikoeritrin (1mg / mL)	Moleküler Problar	S-866 Serisi	Muhabir olarak kullanılır
MES (2- [N-Morfolino] etansülfonik asit)	Sigma	M-2933	Kaplin için kullanılır
Ara-20 (Polioksietilenorbitan monolaurat)	Sigma	P-9416	Spesifik olmayan bağlanmayı gidermek için yıkama tamponunda kullanılır
Protein Tamponları
PBS-TBN Engelleme/Depolama Tamponu (PBS, %0,1 BSA, %0,02 Ara-20, %0,05 Azide, pH 7,4)**			Filtre: Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın
PBS, pH 7.4	Sigma	P-3813 Serisi	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
Bsa	Sigma	A-7888	%0,1 (a/h)
Ara-20	Sigma	P-9416	%0,2 (h/h)
Sodyum Azid (%0,05 azid)**	Sigma	S-8032 Serisi	** Dikkat: Sodyum azid akut toksiktir. Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Uygun KKD'ler giyin. Yürürlükteki yasalara göre imha edin.
MES/ Birleştirme Tamponu (0,05 m MES, pH 5,0)
MES (2- [N-Morfolino] etansülfonik asit)	Sigma	S-3139 Serisi
5 N NaOH	balıkçı	SS256-500
Tahlil Tamponu (PBS, %1 BSA, pH 7.4)			Filtre: Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın
PBS, %1 BSA, pH 7.4	Sigma	P-3688 Serisi	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, %1 BSA
Aktivasyon Tamponu (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)			Filtre: Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın
NaH2PO4 (Sodyum fosfat, monobazik susuz)	Sigma	S-3139 Serisi	0.1M NaH2PO4
5 N NaOH	balıkçı	SS256-500
Yıkama Tamponu (PBS, %0,05 Ara-20, pH 7,4)			Filtre: Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın
PBS, %0.05 Ara-20, pH 7.4	Sigma	P-3563 Serisi	138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, %0.05 TWEEN