Mantar Sporu Fagositozunun İnsan Fagositleri ile Kantitatif Akış Sitometrik Ölçümü

Özet

Kaynak: Hartung, S., et al., Aspergillus fumigatus Conidia'nın Fagositozunun İnsan Lökositleri tarafından Akış Sitometrisi kullanılarak ölçülmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, insan lökositleri tarafından FITC etiketli patojenik mantar sporlarının fagositozunu ölçmek için bir yöntem göstermektedir. Fagositozlu sporlar, karşı boyama yoluyla hücreye bağlı sporlardan ayırt edilir, ardından akış sitometrik analizi yapılır.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Fagositoz Testi

1. 12 oyuklu bir hücre kültürü plakasında 1.5 mL RPMI +% 10 FCS'de 2 x 10⁶ lökosit ve 4 x 10⁶ FITC etiketli conidia (enfeksiyon çokluğu = 2) inkübe edin. Kontroller olarak, yalnızca hücreleri (conidia yok) ve hücreleri + etiketlenmemiş conidia'yı dahil edin.
2. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO₂ inkübatöre yerleştirin ve istenen süre boyunca inkübe edin (örneğin, 0,5 saat, 2 saat veya 4 saat).
3. İnkübasyondan sonra, hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe koyun.
4. Oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika döndürün.
5. Sitokin analizi için süpernatan toplayın veya istenmiyorsa atın. Her numuneyi 100 μL PBS + 2 mM EDTA içinde yeniden süspanse edin.

2. Antikor Boyama

1. Her numune için, Tablo 1'e göre APC anti-FITC antikoru da dahil olmak üzere 100 μL antikor karışımı hazırlayın.
2. 100 μL'lik bir numuneyi 96 oyuklu bir V-alt plakanın bir oyuğuna koyun. Yıkama için 150 μL PBS + 2 mM EDTA ekleyin.
3. Renk telafisi için, 96 oyuklu V alt plakanın diğer kuyucuklarına her renk için 1 x^{10 6} hücre yerleştirin. Lekelenmeden bırakılan bir hücre kuyusu ekleyin. Yıkama için 150 μL PBS + 2 mM EDTA ekleyin.
4. Plakayı yapışkan bir folyo ile örtün.
5. Oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika döndürün. Folyoyu çıkarın.
6. Plakayı lavabonun üzerinde yalnızca bir kez veya tek kullanımlık bir kağıt havluyla hızlı ve güçlü bir şekilde ters çevirerek süpernatanı atın.
   NOT: Plakayı kuruyana kadar tekrarlamayın veya bir kağıda vurmayın, çünkü bu, plakadan büyük bir hücre kaybına neden olur.
7. 100 μL antikor karışımındaki hücreleri yeniden süspanse edin ve pipetleyerek iyice karıştırın.
8. Renk telafisi için, ilgili hücreleri 100 μL PBS + 2 mM EDTA içinde yeniden süspanse edin ve her bir oyuğa antikor karışımında kullanılan aynı miktarda tek bir antikor ekleyin.
9. Yapışkan bir folyo ile örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
10. Folyoyu çıkarın. Yıkama için her kuyucuğa 150 μL PBS + 2 mM EDTA ekleyin. Yapışkan bir folyo ile örtün.
11. Oda sıcaklığında 300 x g'da 5 dakika döndürün. Folyoyu çıkarın. Plakayı lavabonun veya tek kullanımlık bir kağıt havlunun üzerinde hızlı ve güçlü bir şekilde ters çevirerek süpernatanı atın.
12. 200 μL PBS + 2 mM EDTA'da yeniden süspanse edin ve hücreleri her kuyucuktan ayrı bir yuvarlak tabanlı tüpe aktarın. Süspansiyonda hücre kümesi olmadığından emin olun. Aksi takdirde kümeleri kaldırın.
    NOT: Gözün görebileceği kadar büyük olan her küme, sitometreyi potansiyel olarak tıkayacak kadar büyüktür.

3. Akış Sitometrisi

1. Akış sitometresini başlatın ve ısınmasına izin verin. Edinme yazılımını başlatın.
2. Yeni bir deney oluşturun ve örnekleri ayarlayın ve etiketleyin.
3. FITC, APC, BUV395, V500 ve PerCP-Cy5.5 floroforları için parametreleri (FSC 250, SSC 250) ve dedektörleri ayarlayın.
4. Ücretlendirme kurulumu
   1. Ücretlendirme kurulumunu açın.
   2. Tek tek renkleri belirtin.
   3. Boyanmamış veya ayrı ayrı boyamalara sahip kontrol hücrelerini kullanarak, PMT dedektör voltajlarını ölçek içindeki tüm olayları içerecek şekilde ayarlayın.
   4. Her denetimin en az 10.000 olayını kaydedin.
   5. Floroforların yayılmasını hesaplamak ve deneyin sitometre ayarlarına uygulamak için kompanzasyon kurulumunu kullanın.
5. Örnek verilerin kaydedilmesi
   1. Edinme yazılımında FSC ve SSC'yi görüntüleyin ve lökositlerin etrafına bir kapı ayarlayın.
   2. Lökosit kapısına bağlı olarak, nokta grafiği SSC / CD45'i ve CD45 ⁺ hücrelerinin conidia'dan ayrılması için kapıyı görüntüleyin.
   3. CD45⁺ hücrelerini nokta grafiğinde görüntüleyin: CD14 / CD66b ve kapı monositleri (CD14 ⁺) ve nötrofiller (CD66b ⁺) ayrı ayrı.
   4. Nötrofilleri bir nokta grafiği anti-FITC/FITC'de görüntüleyin.
   5. Numuneyi etiketlenmemiş conidia ile kullanarak, anti-FITC ve FITC sinyalleri için kadranları ayarlayın ve ilgili kadranlardaki hücrelerin maksimum% 1'ine izin verin.
   6. Monosit kapısı için 3.5.4 ve 3.5.5 adımlarını tekrarlayın.
   7. Lökosit kapısında en az 20.000 olay içeren tüm örnekleri kaydedin.

Tablo 1: Akış sitometrisi için antikor karışımı. Her bir reaktifin miktarları, analiz edilecek numune başına (1 x 10⁶ hücre) mikrolitre olarak verilir.

Serisi Serisi

reaktif	numune başına μl
CD45 BUV395	1
CD14 V500	0,5
CD66b PerCP-Cy5.5	1.5
anti-FITC APC	0,5
PBS + 2 mM EDTA	97
toplam	100

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yapışkanlı folyo	dağlamak	701367
Hücre kültürü plakası, 12 oyuklu	Greiner Biyo-bir	665180
Sitometre	BD Biyolojik Bilimler		LSR Fortessa II, lazerler: 488 nm (mavi), 405 nm (mor), 355 nm (UV) ve 640 nm (kırmızı)
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma Aldrich	ED3SS-500g	PBS'de 2 mM
Floresein izotiyosiyanat (FITC)	Sigma Aldrich	F3651-100MG	Na2CO3 / PBS çözeltisinde 0.1 mM
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	ThermoFisher Bilimsel	189012-014	Kalsiyum içermez, Magnezyum içermez
dev/dak 1640	ThermoFisher Bilimsel	61870010	RPMI 1640 Orta, GlutaMAX Takviyesi
Veri toplama ve analizi için yazılım	BD Biyolojik Bilimler
V-alt plaka, 96 kuyu	dağlamak	781601	İşlenmemiş yüzey
Formaldehit	Carl Roth'un fotoğrafı	PO87.3	Histofix (Özet Bağlantı)

· · Serisi .