Memeli Stres Granüllerini Karakterize Etmek ve Ölçmek için Bir İmmünofloresan Testi

Özet

Kaynak: Aulas, A. et al., Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri.J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, mRNA'lar, RNA bağlayıcı proteinler (RBP'ler) ve diğer çeşitli proteinlerden oluşan memeli stres granüllerini karakterize etmek ve ölçmek için bir testi göstermektedir.

Protokol

1. Hücre Hazırlığı

1. Şekil 1A'da gösterildiği gibi 24 oyuklu bir plakanın 12 oyuğuna otoklavlanmış lameller ekleyin; bu, her bir lamel almak için bir vakuma bağlı steril bir Pasteur pipeti kullanılarak yapılabilir. Emmeyi serbest bırakmak için kuyunun yan tarafındaki lameli hafifçe vurun ve lamelin kuyuya düşmesine izin verin.
2. Plaka: 1 x 10,⁵ U-2 OS (U2OS) osteosarkom hücreleri, 500 μL ortamın son hacminde oyuk başına. Hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için plakayı birkaç kez yan yana ve yukarı ve aşağı hareket ettirin.
3. Lamelin kuyunun dibinde olduğundan ve lamel altında kabarcık olmadığından emin olmak için lamelleri temiz bir P1000 uçla hafifçe bastırın.

2. Stresli Hücreler

1. Ertesi gün, numuneler arasındaki farklılıklar sonuçların tekrarlanabilirliğini olumsuz yönde etkileyebileceğinden, hücrelerin eşit şekilde dağıldığından ve lamel boyunca eşit şekilde birleştiğinden emin olmak için plakayı görsel olarak kontrol edin. Ters doku kültürü mikroskobunda 10X objektif kullanın.
2. Ortamı önceden 37 °C'ye ısıtın. Hücrelere soğuk veya sıcak ortam uygulamaktan kaçının, çünkü bunlar sırasıyla soğuk şoka veya ısı şokuna neden olur.
3. İlaçları önceden ısıtılmış ortamda seyreltin. Her farklı ilaç konsantrasyonu için 500 μL ortam içeren 2 kuyucuk hazırlayın. Pipetleme sırasında kaybı önlemek için 500 μL daha hazırlayın. Her biri 1,5 mL içeren 4 tüp içerir.
   1. Sodyum arsenit için: 500 μL içeren her oyuğa 1.5 μL 100 mM sodyum arsenit (nihai konsantrasyon: 100 μM) ekleyin veya 0.75 μL 100 mM sodyum arsenit (son konsantrasyon: 50 μM) ekleyin.
   2. Vinorelbin için: 500 μL içeren her oyuğa 22.5 μL 10 mM vinorelbin (son konsantrasyon: 150 μM) ekleyin veya 18.75 μL 10 mM vinorelbin (son konsantrasyon: 100 μM) ekleyin.
      not: Sodyum arsenit, iyi karakterize edilmiş ve yaygın olarak kullanılan bir stres granül indükleyicisidir ve bu nedenle klasik olarak pozitif bir kontrol olarak kullanılır.
4. Ortamı B1 - 4 ve C1 - 4 kuyularından çıkarın ve atın. İlaçlı besiyerini ekleyin ve 60 dakika bekleyin (Şekil 1A).
   1. B1 ve B2 kuyularına 100 μM sodyum arsenit içeren 500 μL ortam ekleyin. B3 ve B4 kuyularına 50 μM sodyum arsenit içeren 500 μL ortam ekleyin.
   2. C1 ve C2 kuyularına 150 μM vinorelbin ile 500 μL ortam ekleyin. C3 ve C4 kuyularına 125 μM vinorelbin ile 500 μL ortam ekleyin.
5. Fiksasyondan 30 dakika önce, sütun 2'deki kuyucukları 5 μL sikloheksimid (1 mg / mL stok) ve sütun 4'teki kuyucukları 2 μL puromisin (1.25 mg / mL stok) ile tedavi edin. Plakayı 37 °C inkübatöre geri yerleştirmeden önce karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın.

3. Hücre Fiksasyonu ve İmmünofloresan

NOT: Deneyden önce metanolün -20 °C'ye soğutulduğundan emin olun. PBS'de Fosfat tamponlu Salin (PBS), %5 Normal At Serumu (NHS) ve PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) dahil olmak üzere tamponlar yapın.

1. Ortamı atın ve lamelleri içeren kuyuları PBS ile yıkayın. Kullanılan ilaçlara bağlı olarak, medya içeren ilaçların uygun şekilde atılması önemli olabilir; Özel talimatlar için yerel Çevre Güvenliği Ofisi ile iletişime geçin. Verimli bir şekilde yıkamak için, bir sıkma şişesini PBS ile doldurun, sıkı bir akış yerine yumuşak bir akışa izin vermek için ucu kesin ve orijinal PBS'yi aspire ettikten sonra her bir kuyucuğa PBS eklemek için bunu kullanın.
2. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ~ 250 μL% 4 PFA kullanarak sabitleyin, hafif çalkalama altında RT. Lamelin üst kısmını PFA ile tamamen örtün; 250 μL yeterli olmalıdır, ancak değilse daha fazlasını ekleyin. Bazı hücreler (veya hücrelerin stres işlemleri) bağlanmayı değiştirebileceğinden ve pipetlemeden kaynaklanan kuvvet hücreleri yerinden oynatabileceğinden, her zaman doğrudan lamellerin üzerine pipetleme yapmaktan kaçının.
3. PFA'yı çıkarın ve uygun şekilde atın. Paraformaldehitin nasıl düzgün bir şekilde atılacağına ilişkin ayrıntılar için yerel çevre güvenliği ofisi ile iletişime geçin.
4. ~ 250 μL metanol (-20 ° C) ekleyin ve hafif sallanma altında RT'de 5 dakika inkübe edin; bu hem hücrelere nüfuz eder hem de düzleştirir.
5. Metanolü çıkarın ve atın ve 250 μL %5 NHS'yi RT'de gece boyunca, O/N, 4 °C'de 1 saat uygulayarak hücreleri bloke edin. Metanolün nasıl düzgün bir şekilde atılacağına ilişkin ayrıntılar için yerel çevre güvenliği ofisi ile iletişime geçin.
6. Birincil antikorlar için, antikorları% 5 NHS.
   not: Birden fazla SG markörünün kullanılması, gözlemlenen granüllerin gerçek SG'ler olup olmadığını doğrulamanın anahtarıdır. Kullanılabilecek SG işaretleyicilerinin sayısı, mikroskopta bulunan filtrelere bağlıdır. Standart yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı filtre setleri mevcutsa, 1/250 seyreltmede G3BP1, eIF4G ve eIF3b kullanın.
   1. Bu deney için (her biri 250 μL'de 12 lamel - Toplam: 3 mL% 5 NHS), aşağıdakilerin her birinden 12 μL ekleyin: anti-G3BP1, anti-eIF3b ve anti-eIF4G. Primer antikorları 4 ° C'de RT veya O/N'de en az 1 saat hafif ajitasyon kullanarak inkübe edin.
7. Kuyuları 3x PBS ile yıkayın ve her yıkamayı 5 dakika inkübe edin.
8. İkincil antikorlar için, tüm ikincil antikorları (1/250 seyreltme) ve Hoechst boyasını (1/1.000 seyreltme)% 5 NHS'de seyreltin.
   1. Bu deney için (her biri 250 μL'de 12 lamel - Toplam: 3 mL% 5 NHS), aşağıdakilerin her birinden 12 μL ekleyin: Cy2-Fare, Cy3-Tavşan ve Cy5-Keçi (her birinin 1/250 seyreltilmesi) ve 3 μL Hoechst boyası ekleyin.
   2. Lamelleri RT'de 1 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin. Bu ve sonraki adımlar sırasında, plakayı bir kutu ile kaplayarak veya doku kültürü kabının üzerine folyo yerleştirerek numuneleri ışıktan koruyun.
9. Kuyuları PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
10. Lamelleri bir montaj ortamı kullanarak etiketli cam kızaklara monte edin. Montaj ortamını 37 °C'lik bir ısı bloğunda 10 dakika ısıtın; Bu, viskoziteyi azaltır ve pipetlemeyi kolaylaştırır. Kesilmiş bir P200 ucu ile, lamel başına 25 μL montaj ortamını bir cam slayt üzerine pipetleyin; Mikroskop aşamasının buna izin verdiğini varsayarsak, 4-8 lamel bir cam lam üzerine sığabilir. İnce forseps kullanarak, lameli kuyudan slayta aktarın ve hücre tarafını montaj ortamına aşağı bakacak şekilde koyduğunuzdan emin olun. Temiz bir P200 ucu kullanarak lamel aşağı doğru bastırın.
11. Tüm lameller monte edildikten sonra, laboratuvar mendilini sürgünün üzerine çok sıkı bir şekilde bastırarak fazla montaj ortamını temizlemek için katlanmış laboratuvar kağıdı kullanın. Fazla montaj ortamını temizlemek için H_2Oiçeren bir sıkma şişesi kullanın ve ardından suyu çıkarmak için katlanmış laboratuvar mendili ile kurutma işlemini tekrarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Deneysel Diyagramlar. (A) Belirtildiği gibi, daha önce 24 oyuklu bir plakaya yerleştirilmiş lameller üzerine tohum hücreleri. A ve B Sıralarını, belirtildiği gibi μM cinsinden konsantrasyonu kullanarak SA veya VRB ile 60 dakika boyunca tedavi edin. 60 dakika sonra, ilaç içeren ortama CHX (son konsantrasyon: kolon 2 için 20 μg / mL) veya puro (kolon 4 için 20 μg / mL puromisin...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
U-2 İşletim Sistemi	ATCC (Uzay Servisi)	ATCC®HTB-96™	- genellikle "U2OS" olarak yazılır - 37 °C'de %5 CO2'nin altında %10 FBS/DMEM'de kültür
Dulbecco'nun Eagle's Medium'u Modifikasyonu	Corning	10-013-Özgeçmiş	- kısaltılmış DMEM - 4,5 g/L glikoz, piruvat ve fenol kırmızı içerir - %10 FBS, 10 mM HEPES ve penisilin / steptomisin ile desteklenmiştir - Önceki İlaç (lar) Seyreltme < Br / > Önceden ısıtın - önceki ilaç (lar) seyreltme
Fetal Sığır Serumu	Sigma	F2442-500ml	- kısaltılmış FBS - medyayı desteklemek için kullanılır
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Bilimsel	15630-080	- medyayı desteklemek için kullanılır
Penisilin Streptomisin	Sigma	P0781-100ml	- medyayı desteklemek için kullanılır
24 kuyulu plaka	Yardımcı yıldız	3524
Laboratuvar dokuları	KIMTECH BİLİM	34120	- Yaygın olarak "kimwipes" olarak adlandırılır
Büyüme Kapak Camları için Coverglass	Balıkçı Bilimsel	12-545-82	- Kullanılmadan önce otoklavlanmış - Doku kültürü başlığında steril tutun
Sodyum (meta)arsenit ≥%90	Sigma	S7400-100G	- yaygın olarak sodyum arsenit olarak adlandırılır ve kısaltılmış SA - 1 M konsantrasyonda suda çözün, daha sonra bir çalışma stoğu olarak 100 μM'ye seyreltin
Vinorelbin	TSZ KIMYA	RS055	- kısaltılmış VRB - suda 10 mM'ye kadar çözülür
Puromisin	Sigma	P9620 Serisi	- Translasyon seviyesini değerlendirmek için kullanılır (Ribopuromycylation) - aktif çeviri ile SG bağlantısını değerlendirmek için kullanılır - su ile 10 mg / mL'ye seyreltin
Emetine dihidroklorür hidrat	Sigma	E2375	- Genel çeviri seviyesini değerlendirmek için Puro ile birlikte kullanılır - aktif çeviri ile SG bağlantısını değerlendirmek için kullanılır - su ile 10 mg / mL'ye seyreltin
Sikloheksimid	Sigma	C4859	- kısaltılmış CHX - aktif çeviri ile SG bağlantısını değerlendirmek için kullanılır - su ile 10 mg / mL'ye seyreltin
Fosfat Tamponlu Tuzlu	Lonza / VWR	95042-486	- kısaltılmış PBS - immünofloresan için yıkama tamponu
Paraformaldehit reaktif sınıfı, kristal	Sigma	P6148-500G	- çeker ocakta sıcak PBS'de% 4'lük bir çözelti yapın, eriyene kadar karıştırın - alikotlar - 20 °C'de birkaç ay saklanabilir - tehlikeli, havalandırma kullanın - özel atıklara atın
Metanol, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- kullanmadan önce -20 ° C'ye önceden soğutulmuş - özel atıklara atın
Normal At Serumu	Thermo Fisher Bilimsel	31874	- kısaltılmış NHS - PBS 'de% 5'e seyreltin - 4 ° C 'de saklamak için sodyum azid ekleyin - İmmünofloresan için bloke edici çözelti
Etanol, Saf, 200 Kanıt (% 100), USP, KOPTEC	Decon Laboratuvarları / VWR	89125-188	- su ile% 70'e kadar seyreltin
Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları	Balıkçı markası	12-550-15
Fare anti G3BP1 antikoru (TT-Y)	Santa Cruz Plajı	SC-81940	- 4 °C 'de saklayın - 1/100 seyreltmede kullanın
Tavşan anti eIF4G antikoru (H-300)	Santa Cruz Plajı	SC-11373	- 4 °C 'de saklayın - 1/250 seyreltme
Keçi anti eIF3η (N-20) antikoru	Santa Cruz Plajı	SC-16377	- eIF3η, eIF3b olarak da bilinir - 4 °C 'de saklayın - 1/250 seyreltme
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Fare IgG (H + L)	Jackson İmmün Araştırma	715-225-150	- üreticinin talimatlarına göre suda sulandırın, ardından 4 ° C 'de saklayın - 1/250 seyreltme
Cy3 AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)	Jackson İmmün Araştırma	711-165-152	- üreticinin talimatlarına göre suda sulandırın, ardından 4 ° C 'de saklayın - 1/2500 seyreltme
Cy5 AffiniPure Eşek Keçi Önleyici IgG (H+L)	Jackson İmmün Araştırma	705-175-147	- üreticinin talimatlarına göre suda sulandırın, ardından 4 ° C 'de saklayın - 1/250 seyreltme
Hoechst 33258 çözümü	Sigma	94403-1ML	- dH20'de 0.5 mg / mL ikincil antikorlar stok çözeltisi ile inkübe edin, ışıktan koruyun - 4 ° C'de saklayın
20 x SSC tamponu	Termo balıkçı Ambion	AM9763	- RNase Free water (DEPC ile muamele edilmiş) kullanarak 2X SSC'ye seyreltin - oda sıcaklığında saklayın - BALIK için yıkama tamponu
Sürgülü montaj ortamı	Ev yapımı	/	- 5 g "soğukta çözünür" poli (vinil alkol) 20 ml PBS içinde karıştırın - sonikasyon ile karıştırın, ardından gece boyunca RT- 5 ml gliserol ve% 20 sodyum azid ekleyin. 5 ml gliserol ve 0.2 ml% 20 sodyum azid ekleyin ve RT'de 16 saat karıştırın. 20 dakika boyunca 20.000 g'da santrifüjleme, büyük pelet alikot viskoz sıvıyı atın, -20°C'de uzun süreli depolama, 4°C'de 1 hafta
Parafilm "M"	Sigma	P7793-1EA	- genellikle "parafilm" olarak anılır
Poli (vinil alkol)	Sigma	P-8136-250G	- vinol yapmak için reaktif
Gliserol	Sigma	G5516-100ML	- vinol yapmak için reaktif
Sodyum azid	Balıkçı Bilimsel	S2002-5G Serisi	- Bloke edici çözelti ve vinol için koruyucu madde - Suda %20 seyreltme yapın

Serisi öncesi ısıtma adet Serisi Serisi Serisi Serisi Su Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi