İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Tahlil Hazırlama
- Prosedür için belirtilen malzemeleri toplayın, hazırlayın ve düzenleyin (lütfen Belirli Malzeme/Ekipman Tablosuna bakın).
- 12 x 75 mm'lik tüpleri etiketleyin.
- Her katılımcı için iki tüpü etiketleyin: fagositoz testi için bir tüp (bu tüpü siyah mürekkeple ve floresein izotiyosiyanat [FITC] için bir "F" ile etiketleyin) ve oksidatif patlama (OB) aktivite testi için bir tüp (bu tüpü kırmızı mürekkeple etiketleyin ve dihidroetidyum [HE] için bir "H").
not: İstenmeyen hücresel aktivasyonu ve buna bağlı arka plan gürültüsündeki artışı en aza indirmek için steril 12 x 75 mm tüplerin kullanılması önerilir.
- Test kontrolleri için üç tüpü etiketleyin: fagositoz testi için bir tüp (FITC kontrolü: bu tüpü siyah mürekkep ve "F" ile etiketleyin), OB aktivite testi için bir tüp (HE kontrolü: bu tüpü kırmızı mürekkep ve "H" ile etiketleyin) ve negatif kontrol için bir tüp (Yalnızca kan: bu tüpü yeşil mürekkeple ve "yalnızca kan" ile etiketleyin).
- Tahlil gününden en az bir gün önce stok çözeltileri hazırlayın.
- Steril fosfat tamponlu salini (PBS) hazırlayın. 100 ml 10x PBS'yi 900 ml 18.2 MΩ H2O ile seyreltin Filtre, 0.2 μm filtre ile sterilize edilir. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- Steril PBS glikozunu hazırlayın. 1.0 g glikozu 100 ml PBS'de çözün. Filtre: 0,2 μm filtre ile sterilize edin. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- Steril 0.1 M sitrat tamponunu hazırlayın. 1.2 g sitrik asit ve 1.1 g sodyum sitratı 100 ml 18.2 MΩ H2O içinde çözün. PH'ı 4.0'a ayarlayın. Filtre: 0,2 μm filtre ile sterilize edin. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- HE stok çözeltisini hazırlayın. 1.0 ml dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1.0 mg HE'yi yeniden süspanse edin. Nazikçe karıştırın, alikotlayın ve kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
- FITC etiketli Staphylococcus aureus (S. aureus) stok çözeltisini (2 x 109 partikül / ml) hazırlayın. 10 mg FITC etiketli S. aureus'u 1.5 ml (veya uygun miktarda) PBS içinde yeniden süspanse edin. Üç adet 500 μl'lik alikotlara bölün ve üreticinin tavsiyesine göre sonikat yapın. Kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
- Etiketlenmemiş S. aureus stok çözeltisini (2 x 109 partikül / ml) hazırlayın. 100 mg etiketlenmemiş S. aureus'u 15 ml (veya uygun miktarda) PBS'de yeniden süspanse edin. Otuz 500 μl'lik alikotlara bölün ve üreticinin tavsiyesine göre sonikat yapın. Kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
- Tahlil gününde taze çalışma solüsyonları hazırlayın.
- HE çalışma çözümünü hazırlayın. 10 μl çözülmüş HE stok çözeltisini 990 μl PBS-glikoza aktarın. Işıktan koruyun ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- FITC etiketli S. aureus çalışma solüsyonunu (133.333 partikül / μl) hazırlayın. 70 μl çözülmüş FITC etiketli S. aureus stok çözeltisini 980 μl PBS'ye aktarın. Işıktan koruyun ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Etiketlenmemiş S. aureus çalışma solüsyonunu (133,333 partikül / μl) hazırlayın. 70 μl çözülmüş etiketlenmemiş S. aureus stok çözeltisini 980 μl PBS'ye aktarın. Işıktan koruyun ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Söndürme çözeltisini hazırlayın. 11.25 ml steril 0.1 M sitrat tamponuna 750 μl% 0.4 tripan mavisi çözeltisi ekleyin. Kullanana kadar buzlu su banyosunda saklayın.
- Dünya Sağlık Örgütü'nün kan alma yönergelerine göre sertifikalı bir flebotomistin kan almasını sağlayın.
- Dipotasyum etilendiamintetraasetik asit (K2EDTA) içeren 4 ml'lik bir kan alma tüpüne kan alın. Kan alma tüpünü üreticinin talimatlarına göre ters çevirin. Kullanana kadar kan alma tüpünü oda sıcaklığında tezgah üstü bir külbütör üzerinde tutun. Adım 1.2.1'de açıklanan beyaz kan hücresi (WBC) diferansiyel analizi ile tam kan sayımı (CBC) için bu kanı kullanın.
- Lityum heparin içeren 4 ml'lik bir kan alma tüpüne kan alın. Kan alma tüpünü üreticinin talimatlarına göre ters çevirin. Kullanana kadar kan alma tüpünü oda sıcaklığında (RT) tezgah üstü bir külbütör üzerinde tutun. Adım 2'de açıklanan monosit ve granülosit fagositozu ve OB aktivite testi için bu kanı kullanın.
- Her numune için testi tamamlamak için ihtiyaç duyulacak bakteri miktarını (yani S. aureus) belirleyin.
- Üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi kan üzerinde WBC diferansiyel analizi ile bir CBC gerçekleştirmek için bir hematoloji analizörü kullanın. WBC sayısını (hücre/ml cinsinden), %Nötrofil ve %Monosit değerlerini not edin.
- Her numune için nötrofil ve monosit sayılarını belirlemek için aşağıdaki denklemleri kullanın.
Nötrofil sayısı (hücre içi/ml) = %Nötrofil × WBC (hücre/ml)
Monosit sayısı (hücre sayısı/ml) = %Monosit × WBC (hücre/ml)
- Her numune için fagosit sayısını ve numunenin 100 μl'sinde bulunan fagosit sayısını belirlemek için aşağıdaki denklemleri kullanın.
Fagosit sayısı (hücre sayısı/ml) = Nötrofil sayısı (hücre/ml) + Monosit sayısı (hücre/ml)
100 μl'deki fagosit sayısı = (Fagosit sayısı (hücre/ml))/10
- Her numune için gereken bakteri sayısını (yani S. aureus) ve her tüpe eklenmesi gereken FITC etiketli S. aureus veya etiketsiz S. aureus çalışma çözeltisi (133.333 partikül / ml) miktarını belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın.
not: Hedef bakteri: fagosit oranı 8: 1.
İhtiyaç duyulan bakteri sayısı = 100 μl'deki fagosit sayısı × 8
İhtiyaç duyulan FITC veya etiketsiz çalışma solüsyonu hacmi (μl cinsinden) = (ihtiyaç duyulan bakteri sayısı)/(133.333 parçacık/μl)
2. Testi Gerçekleştir
- Test için tam kan hazırlayın.
- Her katılımcı ve kontrol tüpü için, 100 μl tam kanı lityum heparin kan alma tüpünden uygun şekilde etiketlenmiş 12 x 75 mm'lik bir tüpün dibine aktarmak için uzatılmış uzunlukta bir pipet ucu kullanın. caps.
değiştirin
not: 12 x 75 mm'lik tüplerin kenarlarına kan gelmemesine dikkat edin.
- HE kontrol tüpü de dahil olmak üzere kırmızı mürekkep ve "H" ile etiketlenmiş tüplere 10 μl HE çalışma solüsyonu eklemek için bir mikropipet kullanın. Kapakları değiştirin ve kısa bir süre girdap yapın.
- Tüm tüpleri 37 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin. Ardından, tüm tüpleri hemen 12 dakika boyunca bir buzlu su banyosuna aktarın.
not: Açık bir metal raf kullanın ve tüplerin hızlı ve yeterince ısıtıldığından veya soğutulduğundan emin olmak için rafı her 5 dakikada bir hafifçe sallayın.
- Numuneye ve kontrol tüplerine bakteri (yani S. aureus) ekleyin.
- HE kontrol tüpü de dahil olmak üzere kırmızı mürekkep ve bir "H" ile etiketlenmiş tüplere uygun miktarda (Adım 1.2.4'te hesaplanan) etiketlenmemiş S. aureus çalışma solüsyonu eklemek için bir mikropipet kullanın. Kapakları değiştirin ve kısa bir süre girdap yapın.
- FITC kontrol tüpü de dahil olmak üzere siyah mürekkep ve "F" ile etiketlenmiş tüplere FITC etiketli S. aureus çalışma solüsyonunun uygun miktarını (Adım 1.2.4'te hesaplanan) eklemek için bir mikropipet kullanın. Kapakları değiştirin ve kısa bir süre girdap yapın.
- "Sadece kan" kontrol tüpünü girdaplayın, ancak ona her iki bakteri türünü de (yani S. aureus) eklemeyin.
- Tüm tüpleri 37 ° C'lik bir su banyosunda 20 dakika inkübe edin. Açık bir metal raf kullanın ve tüplerin hızlı ve yeterince ısınmasını sağlamak için rafı her 5 dakikada bir hafifçe sallayın. Kuluçka süresinden sonra, tüm tüpleri hemen 1 dakika boyunca bir buzlu su banyosuna aktarın.
- Hücreleri yıka.
- Tüm tüplere 100 μl buz gibi soğuk söndürme solüsyonu eklemek için bir tekrarlayıcı pipet kullanın. Kapakları değiştirin, kısa bir süre girdap yapın ve ardından tüm tüpleri 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Tüm tüplere 1 ml buz gibi soğuk PBS eklemek için bir tekrarlayıcı pipet kullanın. Kısa bir süre vorteksleyin ve ardından tüm tüplere 2 ml daha buz gibi soğuk PBS ekleyin ve kapakları değiştirin. Tüm tüpleri 5 dakika boyunca 4 ° C'de ve 270 x g'de santrifüjleyin ve ardından süpernatanı aspire edin.
- Adım 2.3.2'yi bir kez tekrarlayın (toplam 2 yıkama).
- Akış sitometrisi için numuneler hazırlayın.
- Tüm tüplere 50 μl buz gibi soğuk fetal sığır serumu eklemek için tekrarlayıcı bir pipet kullanın. Kısaca tüm tüpleri girdaplayın.
- Tüm tüpleri uygun bir atlıkarıncaya aktarın ve RBC'leri parçalamak ve WBC'leri üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi sabitlemek için kırmızı kan hücresi (RBC) parçalama ve WBC sabitleme reaktifleri içeren otomatik bir hücre parçalama hazırlama iş istasyonu kullanın.
