Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Deney Düzeneği
- Filtre kağıdı yaprakları kullanın (lifli hidroksillenmiş polyester tabakalar, Malzeme Tablosuna bakın).
- 1 aylık bir çocuk için 3 x 15 mm boyutunda ve daha büyük çocuklar ve yetişkinler için L şeklinde şeritler kesin (5 x 20 x 10 mm (L'nin kısa kolu)).
- Forseps kullanarak bir bebeğin her burun deliğine bir parça filtre kağıdı yerleştirin. Filtre kağıdını alt konkanın ön kısmına yerleştirin (yenidoğanlarda burun deliğinin yaklaşık 1 cm içinde ve diğer tüm yaşlarda 1,5 cm).
- Yenidoğanları bir yatağa koyun ve rahatlık için onlara şekerli su verin.
not: Diğer tüm yaşlardaki çocuklar için, örnekleme en kolay şekilde denek bir sandalyeye otururken gerçekleştirilir.
- Daha büyük çocuklar için, L şeklindeki filtre kağıdının uzun kolunu her burun deliğine yerleştirin.
- Rahatsızlığı en aza indirmek ve filtre kağıdının kazara kaybolmasını önlemek için burun deliklerinin etrafına bir burun klipsi uygulayın.
- 2 dakika emilimden sonra filtre kağıtlarını çıkarın.
- Filtre kağıtlarını etiketli tüplere yerleştirin ve hemen -80 °C'de dondurun.
- Numune alma gününde çocuk tarafından gösterilen hava yolu enfeksiyonu belirtilerini not edin.
- Örneklemenin 2 dakikası sırasında meydana gelen herhangi bir hapşırma, sürekli ağlama veya burun kanamasını kaydedin.
2. Havayolu İmmün Mediatörlerinin Miktar Tayini
- Dondurucudan 10'a kadar rastgele numune alın. Kimlik numaralarını kaydedin. Tüm çalışma süreci boyunca numuneleri buz üzerinde tutun.
- Buz üzerinde çözdürdükten sonra, her iki burun deliğinden gelen filtre kağıtlarını (konu başına) 300 μL taze hazırlanmış tampona daldırın (Malzeme Tablosuna bakın) ve 25 mL tampon başına bir tam proteaz inhibitör tableti (Malzeme Tablosuna bakınız) içerir.
- Tamponun hacmini filtre kağıdının boyutuna göre ayarlayın.
- 3 x 15 mm boyutundaki filtre kağıtları için 300 μL tampon kullanın.
- Yalnızca bir filtre kağıdı mevcutsa, tampon hacminin yarısını (150 μL) kullanın.
- Numuneleri 5 dakika boyunca bir plaka çalkalayıcıya (400 rpm) aktarın. Bir zamanlayıcı kullanın.
- Nemli filtre kağıtlarını ve tahlil tamponunu, bir mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirilmiş bir selüloz asetat tüp filtresinin (0.22 μm gözenek boyutu) kabına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Tüpte filtrelenmiş burun özütü elde etmek için soğutulmuş bir santrifüjde (4 ° C'de) 5 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
- Bardağı çıkarın ve burun ekstraktını düşük proteinli bağlayıcı saklama plakalarının kuyucuklarına alikorken tüpleri buz üzerinde tutun (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Analize kadar -80 °C'de saklayın.
- Yüksek hassasiyetli, elektrokemilüminesans tabanlı çoğullanmış dizi sistemi kullanarak burun ekstraktlarındaki sitokin ve kemokin konsantrasyonlarını belirleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
c: Burada bir insan 10-pleks TH1 / TH2 sitokin testi, 9-pleks kemokin testi ve tek pleks interlökin-17A (IL-17A), transforme edici büyüme faktörü-beta1 (TGF-β1) ve timik stromal lenfopoietin (TSLP) yapıldı.
- Tahliller için, burun özlerini gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Ölçümleri standart üretici protokolüne göre gerçekleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
not: İmmünoanalizler (Malzeme Tablosuna bakınız) tipik olarak 1 ila 10.000 pg / mL arasında değişen ölçüm için yüksek bir dinamik aralığa sahiptir, ancak bazı testler için 100.000 pg / mL olabilir. Bu, tüm numunelerin aynı seyreltmede çalıştırılabileceği anlamına gelir, böylece diğer benzer immünolojik testlerde olduğu gibi, sağlıklı ve hastalıklı deneklerde farklı seyreltmelerin etkisini sınırlar. Tüm sitokinler için alt saptama sınırı 1 pg / mL veya daha azdı ve kemokinler için 1 ila 50 pg / mL arasında değişiyordu. TSLP, 1 aylıkken örneklerin% 98'inde tespit edilemedi.
