Proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir florojenik peptit bölünme testi

Abstract

Kaynak: Jaimes, J. A., et al. Proteolitik Aktiviteyi Taramak için Bir Florojenik Peptit Bölünme Testi: Koronavirüs spike protein aktivasyonu uygulamaları. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, florojenik peptitler kullanılarak proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir testi göstermektedir. Proteaz, peptit üzerindeki bölünme bölgesini tanır, onu parçalar ve söndürücüyü florofordan ayırarak floresan emisyonunu sağlar. Floresan sinyali, farklı peptit varyantlarının bölünme verimliliğini kontrol etmek için tespit edilir ve analiz edilir.

Protocol

1. Peptitlerin Tasarlanması ve Hazırlanması

1. İlgilenilen füzyon proteininin dizisini NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) veya virüs patojen veri tabanı (https://www.viprbrc.org) gibi halka açık bir veri tabanından alın. Füzyon peptidinden önceki proteaz tanıma bölgesini seçin ve bu dizinin yukarı ve aşağı akışında 2-3 amino asit ekleyin.
2. Peptitleri sipariş ederken, bunları N-terminalinde FRET çifti 7-metoksikumarin-4-il asetil (MCA) ve C-terminalinde N-2,4-dinitrofenil (DNP) ile modifiye edin.
   not: Birkaç tedarikçi bu değişiklikleri sağlar. Fiyat ve teslim süresi, tercih edilen tedarikçiye bağlıdır. Bununl....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptidler	Biyomatik	Yok
Kürk	NEB (Türkçe)	P8077S Serisi
Tripsin, TPCK ile tedavi edildi	Sigma-Aldrich	4352157-1KT
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma-Aldrich	H3375
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
2-Merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
Triton-X100	Sigma-Aldrich	X100
Pbs	Corning	21-040-Özgeçmiş
SpectraMax İkizler XPS	Moleküler Cihazlar	XPS (XPS)
SoftMax Pro 6.5.1	Moleküler Cihazlar	Yok
96 oyuklu plaka (düz tabanlı ve işlenmemiş katı siyah polistiren)	Yardımcı yıldız	3915
Işık sönümleme tüpleri	Watson Laboratuvarı	131-915BL veya 131-915BR