$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Peptitlerin Tasarlanması ve Hazırlanması
- İlgilenilen füzyon proteininin dizisini NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) veya virüs patojen veri tabanı (https://www.viprbrc.org) gibi halka açık bir veri tabanından alın. Füzyon peptidinden önceki proteaz tanıma bölgesini seçin ve bu dizinin yukarı ve aşağı akışında 2-3 amino asit ekleyin.
- Peptitleri sipariş ederken, bunları N-terminalinde FRET çifti 7-metoksikumarin-4-il asetil (MCA) ve C-terminalinde N-2,4-dinitrofenil (DNP) ile modifiye edin.
not: Birkaç tedarikçi bu değişiklikleri sağlar. Fiyat ve teslim süresi, tercih edilen tedarikçiye bağlıdır. Bununla birlikte, hassasiyete göre değişen ve plaka okuyucunun dalga boyları açısından ayarlanmasını gerektiren alternatif modifikasyonlar mevcuttur.
- Peptidi üreticinin tavsiyelerine göre hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Örneğin, peptitleri% 70 etanol içinde 1 mM'lik nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin.
- İsteğe bağlı olarak, peptit ve çözücüyü içeren tüpü, peptit pipetleme ile çok iyi bir şekilde yeniden süspanse edilmezse tamamen yeniden süspanse edilene kadar bir sonikasyon banyosuna ekleyin.
- Peptiti ağartmadan korumak için peptidi ışık sönümleyici veya dirençli tüplere koyun. Birden fazla donma/çözülme döngüsünden kaçınmak için alikot boyutlarını küçük tutun (örn., 100 μL). Alikotları -20 ° C'de saklayın.
2. Floresan Plaka Okuyucunun Hazırlanması
- Plaka okuyucuyu açın ve kendi kendine test bitene kadar bekleyin.
- Bağlı bilgisayardaki işletim yazılımını açın ve plaka okuyucuya bağlı olduğundan emin olun.
- Sıcaklık ayarını açın ve 30 °C'ye (veya proteaz için optimum performans için gereken sıcaklığa) ayarlayın.
- Kontrol Et'e tıklayın | Deneyi kurmak için Cihaz Kurulumu.
- Kinetik'i seçin.
- Floresan'ı seçin.
- Uyarma ve Emisyon dalga boylarını girin: sırasıyla 330 nm ve 390 nm.
- Otomatik Kesme seçeneğinin işaretini kaldırın.
- Orta, normal hassasiyet'i seçin.
- Test için 1 saatlik bir çalışma süresi seçin ve her 60 saniyede bir ölçüm seçin.
- İlk ölçümden önce 5 sn ve her ölçümden önce 3 saniye karıştırmayı ayarlayın
- Okumak ve testi başlatmak için kuyuları seçin.
3. Tahlilin Hazırlanması
- Her bir bileşen için uygun miktarları hesaplayarak ve ekleyerek tahlil tamponunu hazırlayın. Furin için 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol ve% 5 Triton X-100'den oluşan bir tampon yapın. Tripsin için standart fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi kullanın.
not: 10 mL veya daha az hacimler yeterlidir. Testte kullanılan proteaz(lar)a bağlı olarak tampon değişir.
- Tamponu buz üzerinde soğutun.
- Soğutma ve stabiliteyi desteklemek için tahlil plakasını altında ince bir metal plaka bulunan buzun üzerine yerleştirin. Düz tabanlı ve işlenmemiş katı siyah polistiren 96 oyuklu bir plaka kullanın.
not: Bitişik kuyulardan floresan "sızıntısını" önlemek için siyah plakaların kullanılması önemlidir.
- Önceki yayınlara veya deneysel verilere dayanarak her reaksiyon için eklenecek uygun proteaz miktarını hesaplayın. Furin için, reaksiyon başına 0.5 μL'ye karşılık gelen 1 birim kullanın. Tripsin için 0,5 μL 160 nM TPCK tripsin kullanın.
- Numune başına, numune başına toplam 100 μL hacimde tahlil başına 3 teknik kopya hazırlayın.
not: Pipetlemenin normal ışık koşullarında mı yoksa loş ışık altında mı yapıldığının bir fark yaratmadığı deneysel olarak değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, peptitler uzun süre ışığa maruz bırakılmamalıdır.
- Her bir oyuklu içine uygun miktarda tahlil tamponu (Adım 3.1'de açıklandığı gibi 94,5 μL) pipetleyin.
- Proteazı her bir kuyucuğa ekleyin. Hem furin hem de TPCK tripsin için numune başına 0,5 μL kullanın. 6 kuyucuğa (boş kontrol için 3 kuyucuk ve peptit kontrolü için 3 kuyucuk), ilgili proteaz yerine 0.5 μL tampon ekleyin.
- Peptiti, boş kontrol hariç her bir oyukta 50 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Bu durumda, pipet 5 μL peptit, Adım 1.3'te açıklandığı gibi hazırlandı. Boş kontrole peptid yerine 5 μL tampon ekleyin.
not: Enzimlerin doymuş olduğundan emin olmak için peptitin çeşitli konsantrasyonları başlangıçta tarif edilen enzim konsantrasyonları ile test edildi.
- Plakayı floresan plaka okuyucusuna yerleştirin ve başlat'a tıklayın.