İşlevselleştirilmiş nano cisimler kullanılarak GFP etiketli yüzey proteinlerinin trans-Golgi ağına gelişinin izlenmesi

Özet

Kaynak: Buser, D. P., et al. Kültürlenmiş Hücrelerde İşlevselleştirilmiş Nanocisimler Kullanılarak Trans-Golgi Ağına Endositik Alım ve Retrograd Taşınmanın Analizi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, hücre içi trafik yollarını anlamak için işlevselleştirilmiş nano cisimlerin alımını ve geriye dönük taşınmasını incelemek için bir yöntem göstermektedir. Bu yöntem, radyoaktif işaretli sülfatın tanıtılması ve izolasyon ve tespit tekniklerinin kullanılmasıyla, kargo proteinlerinin endositik alımı ve trans-Golgi ağı varışının incelenmesini sağlar.

Protokol

1. İşlevselleştirilmiş Nano Cisimlerin Kültürlenmiş Hücreler Tarafından Alınması (Sülfatlama Analizi için)

1. Bir hücre kültürü davlumbazında, ~ 400.000 ila 500.000 HeLa hücresini, 35 mm'lik tabaklarda veya antibiyotik içeren tam besiyeri olan 6 oyuklu kümelerde GFP etiketli bir raportör proteini stabil bir şekilde eksprese eden tohumlayın (Dulbecco'nun Modifiye Eagle ortamı, DMEM, %10 fetal buzağı serumu (FCS), 100 birim / mL streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 1.5 μg / mL puromisin ile desteklenmiştir).
   not: Yukarıda bahsedildiği gibi, burada örnekleme amacıyla EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR ve TfR-EGFP'yi kararlı bir şekilde ifade eden HeLa hücrelerini kullanıyoruz. Kararlı hücre hatlarının yanı sıra, geçici olarak transfekte edilmiş HeLa da kullanılabilir.
2. Çoğalmak için hücreleri O / N'de% 7.5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
   not: Hücreler ertesi gün ~% 80'lik bir birleşmeye sahip olmalıdır.
3. Ortamın tamamını çıkarın, RT'de 1x PBS ile 2 kez yıkayın ve hücreleri %7,5 CO 2 inkübatörde 37 ° C'de 1 saat boyunca sülfatsız ortam (SFM) ile aç bırakın. /> not: SFM, 10 mL MEM amino asit (50x) çözeltisi, 5 mL L-glutamin (200 mM), 5 mL vitamin çözeltisi (100x) ve 900 μL CaCl₂·2H_2Oila 500 mL Eagle dengeli tuzları eklenerek hazırlanır. 0.22 μm'lik bir filtreden ve alikottan geçirin.
4. Radyoaktivite çalışması için tasarlanmış havalandırmalı bir başlık veya tezgahta, SFM.
   'de sodyum tuzu olarak 0,5 mCi/mL [³⁵S] sülfat içeren bir sülfat etiketleme ortamı hazırlayın Dikkat: Radyoaktivite içeren tüm çözeltileri dikkatlice kullanın. Yalnızca belirlenmiş davlumbazlarda veya banklarda çalışın. Radyoaktivite ile temas eden tüm malzemeler (uçlar, tüpler, plakalar vb.) veya yıkama tamponları ayrı olarak toplanmalı ve atılmalıdır. Bunu aşağıdaki tüm adımlar için de (1.5-1.18. adımlar) yapın.
5. 1x PBS'de VHH-2xTS'yi sülfat etiketleme ortamına 2 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
   not: Bir kontrol olarak, belirli etiketlemeyi göstermek için VHH-std veya TS bölgelerinden yoksun başka bir nano gövdeyi de dahil edin.
6. SFM'yi 0,5 mCi / mL [35S] sülfat ve 2 μg / mL VHH-2xTS içeren 0,7 mL sülfat etiketleme ortamı ile değiştirin ve hücreleri radyoaktivite ile çalışmak üzere tasarlanmış %7,5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
   not: Planlanan deneye bağlı olarak, nano cisim sülfatlama süresinin ayarlanması gerekir. Ek olarak, TGN varış kinetiğini belirlemek için farklı süreler için etiketleme yapılır (örneğin, 10 dakika, 20 dakika, 30 dakika, vb.).
7. Etiketleme ortamını çıkarın ve hücreleri bir soğutma plakası veya buz üzerinde buz gibi 1x PBS ile 2-3 kez yıkayın.
8. 2 mM PMSF ve 1x proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş 1 mL lizis tamponu (% 1 Triton X-100 ve% 0.5 deoksikolat içeren PBS) ekleyin ve hücreleri 4 ° C'de sallanan bir platformda 10-15 dakika inkübe edin.
9. Lizatı kazıyın ve 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın, lizatı vorteksleyin ve 4 ° C'de uçtan uca bir döndürücüde 10-15 dakika bekletin.
10. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleme yoluyla bir nükleer lizat hazırlayın.
11. Yeni bir 1.5 mL tüp kullanarak, 1.5 mL'lik bir tüpte 20-30 μL'lik bir Nikel boncuk bulamacı hazırlayın ve 1.000 x g'da 1 dakika boyunca hafifçe peletleyerek 1x PBS ile bir kez yıkayın>< not: Nikel boncuklar yerine, streptavidin boncukları (nano cisim biyotinile edilmişse) veya nano cismin bir epitopuna (T7- veya HA-etiketi) karşı bir IgG'ye sahip protein A boncukları kullanılabilir.
12. Nükleer sonrası lizatı Nikel boncuklar içeren 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve nano cisimleri izole etmek için uçtan uca bir döndürücü üzerinde 4 ° C'de 1 saat inkübe edin. Nükleer sonrası lizatın bir alikotunu (50-100 μL) çıkarın ve toplam hücre ile ilişkili nano gövdenin, GFP raportörünün ve yükleme kontrolünün müteakip immünoblot analizi için SDS numune tamponunda kaynatın.
13. Boncukları 1 x PBS veya lizis tamponu ile 3 kez 1.000 x g'da 1 dk.
    boyunca hafifçe peletleyerek yıkayın not: Boncukların daha sıkı yıkanması için, PBS veya lizis tamponuna 20 mM imidazol dahil edilebilir.
14. Boncuklardaki tüm yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın, 50 μL 2x numune tamponu ekleyin ve 95 °C'de 5 dakika kaynatın.
15. Her iki haşlanmış boncuğu da midi %12,5 SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve referans boya (örn. bromofenol mavisi) ayırma jelinin sonuna ulaşana kadar standart PAGE protokolüne göre çalıştırın.
    not: Toplam hücre ile ilişkili nano gövdenin, GFP raportörünün ve yükleme kontrolünün immünoblot analizi, mini% 12.5 SDS-PAGE veya prekast gradyan jel kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
16. Ayırma jelini RT'de 1 saat boyunca ~ 30 mL fiksasyon tamponunda (% 10 asetik asit ve% 45 metanol ddH₂O'da) sabitleyin, jeli ~ 50 mL deiyonize su ile üç kez yıkayın ve jel kurutmaya hazırlanın.
17. SDS-PAGE jellerinin kurutulması.​
    1. Sabit jeli dikkatlice gerilmiş streç film üzerine yerleştirin ve önceden kesilmiş filtre kağıdı ile örtün.
    2. Jeli filtre kağıdı aşağı bakacak şekilde kurutma platformunun üzerine yerleştirin, vakum kapağını yerleştirin ve jel kurutma için vakum pompasını açın. Jeli 3-5 saat kurutun.
    3. Streç filmi çıkarın ve kurumuş jeli Fosfor Ekranlı bir otoradyografi kasetine yerleştirin.
18. Fosfor Ekran Görüntüleyici kullanarak görüntü otoradyografı. Üreticinin talimatlarına uyun.
    not: Sinyalin gücüne bağlı olarak, kurutulmuş jellerin Fosfor ekranlarla daha uzun süre maruz kalması gerekir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-GFP antikoru	Sigma-Aldrich	1.18145E+11	Ürün SigmaAldrich tarafından dağıtılmaktadır, ancak Roche tarafından üretilmektedir
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM)	Sigma-Aldrich
Fetal baldır serumu (FCS)	Biyobatı
Sodyum sülfat olarak kükürt-35	Hartmann Analitiği	ARS0105	Ürün 5 mCi içerir
6 oyuklu plakalar	TPP (Cesaret Partisi	92406
Paraformaldehit (PFA)	Uygulama	A3813
Floromount-G	Güney Biyoteknoloji	0100-01
Mini-Protean TGX jelleri, %4-20, 15 kuyulu	Biyo-Rad	456-1096

Gazetesi Gazetesi Serisi