Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Parazit kültürü
NOT: İnsan patojenlerinin işlenmesine ilişkin yerel düzenlemelere uyun.
- Plasmodium falciparum parazitlerini, parazit kültür ortamında daha önce tarif edildiği gibi standart protokole göre koruyun (bkz. Malzeme Tablosu).
- Daha önce tarif edildiği gibi sorbitol tedavisi kullanarak parazitleri sıkı bir şekilde senkronize edin.
- Plasmodium falciparum ile enfekte eritrositlerin (IE) yüzeyinde VAR2CSA ekspresyonunu sağlamak için, bir anti-VAR2CSA antikoru (örneğin, PAM1.4 antikoru, çapraz reaktif bir insan monoklonal VAR2CSA spesifik IgG) kullanarak tekrarlanan bağışıklık-manyetik seçim turları gerçekleştirin.
- Kısacası, geç evre trofozoit-IE'leri bir anti-VAR2CSA antikoruna bağlı manyetik boncuklarla inkübe edin ve bir mıknatıs kullanarak pozitif olarak seçin.
- Parazitemi en az% 5 olana kadar kültürde seçilen parazitleri birkaç döngü genişletin.
- Alternatif olarak, daha önce tarif edildiği gibi plastikle hareketsizleştirilmiş CSA'ya (VAR2CSA reseptörü) bağlanan parazitleri seçin.
- Seçilen parazitler üzerindeki VAR2CSA ekspresyonunu doğrulamak için, daha önce tarif edildiği gibi akış sitometrisi yapın.
- Kısaca, geç evre trofozoit-IE'leri manyetik seçim için kullanılan aynı antikorla (adım 1.3) ve ardından floresan olarak etiketlenmiş bir ikincil antikorla etiketleyin.
- Akış sitometrisi ile IE yüzey reaktivitesini ölçün. Başarılı antikor seçimi normalde parazitlerin çoğunda VAR2CSA ifade eden bir parazit popülasyonu ile sonuçlanır (% ≈80).
- Fagositoz testi için saflaştırılmış orta ila geç evre trofozoit-IE'ler kullanın. Daha önce açıklandığı gibi manyetik ayırma kullanarak saflaştırma gerçekleştirin.
not: Parazitlerin evresini doğru bir şekilde belirlemek için, kan yaymaları üzerinde Giemsa boyama yapın ve ardından ışık mikroskobu gözlemi yapın. Daha önce açıklandığı gibi standart prosedürleri ve morfolojik yönergeleri izleyin. Geç aşama saflaştırma, bir yoğunluk gradyan ortamı kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre IE verimi daha düşüktür ve bu nedenle manyetik saflaştırma tercih edilir.
- Manyetik ayırma için, parazit kültürünü (% 5-10 parazitemi) oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 10 mL parazit kültürü ortamında yeniden süspanse edin.
- Parazit süspansiyonunu bir mıknatısa bağlı bir Claricep Flash Silika, CS sütununa ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve yavaşça sütundan geçmesine izin verin. Trofozoit-IE'ler paramanyetiktir (hemozoin varlığından dolayı) ve kolon ağında kalacaktır.
- Kolonu 50 mL parazit kültürü ortamı ile yıkayın ve 50 mL parazit kültürü ortamı kullanarak IE'leri manyetik kolondan ayırın.
- Elüatı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 x g'da 1.5.3'ten döndürün. Süpernatanı dikkatlice atın ve 1 mL parazit kültürü ortamında tekrar süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak, son parazitemiyi (IE'lerin yüzdesi) hesaplamak için IE'lerin sayısını (ışık mikroskobu ile koyu hemozoin pigmentli eritrositler olarak kolayca tanımlanır) ve toplam hücre sayısını sayın.
not: Yalnızca en az %80 saflıkta (%80 IE) parazitler kullanın.
- Test için planlanan serum/antikor örneklerinin sayısına bağlı olarak, ihtiyaç duyulan toplam IE miktarını tahmin edin ve parazit kültürlerini buna göre ölçeklendirin. % 5 hematokrit ve% 5-10 parazitemide 25 mL kültür içeren 75 cm2'lik bir kültür şişesi, tam 96 oyuklu bir plakayı çalıştırmak için yeterli IE vermelidir. Tam bir plaka için (42 numune artı çift olarak 6 kontrol), 3.3 x 107 IEs/mL'de minimum 1.5 mL parazit süspansiyonu gereklidir.
>2. THP-1 hücreleri
>NOT: Bu tahlilde THP-1 hücre hattı kullanılmıştır. Bu monosit hücre hattı, monositik lösemili bir hastadan türetilir ve Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC) satın alınabilir. Hücre hattını, THP-1 kültür ortamındaki sağlayıcının talimatlarına göre koruyun (bkz. Malzeme Tablosu).
- Düzenli bakım için, THP-1 hücre kültürünü 2-4 x 105 hücre / mL'de başlatın ve hücre konsantrasyonu 8 x 105 hücre / mL'ye ulaştığında alt kültüre başlayın.
not: Hücre konsantrasyonunun 1 x 106 hücre / mL'yi aşmasına izin vermeyin ve geçiş sayısını takip edin. 25. pasajın ötesindeki hücrelerin kullanılmasından kaçının. THP-1 hücre hattının ortalama iki katına çıkma süresi 19-50 saat arasında değişir. Fagositoz deneylerine başlamadan önce hücre partisinin iki katına çıkma süresini belirleyin. Bu, test edilecek belirli sayıda serum numunesi için gereken gerekli kültür miktarını kabaca tahmin etmeye yardımcı olacaktır (ör., tam 96 oyuklu bir plaka için, 5 x 105 hücre / mL'de 10 mL kültüre ihtiyaç vardır).
- THP-1 hücrelerini, daha önce tarif edildiği gibi Fcγ-reseptörleri I (CD64), II (CD32) ve III'ün (CD16) yüzey ekspresyonu için periyodik olarak kontrol edin.
- Kısacası, THP-1 hücrelerini (ayrı ayrı) anti-CD64, anti-CD32 ve anti-CD16 floresan etiketli antikorlarla (Malzeme Tablosu) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca boyayın (1:100 seyreltme) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 2 fetal sığır serumunda (FBS) hazırlanır).
- PBS'de% 2 FBS ile üç kez yıkayın ve akış sitometrisi ile yüzey lekelenmesini ölçün.
not: THP-1 hücreleri, daha önce bildirildiği gibi CD16 için negatif, CD32 ve CD64 için pozitiftir (Şekil 1).
- Fagositoz tahlili için, deneyden bir gün önce 2.5 x 105 hücre / mL içeren bir THP-10 hücre kültürü şişesi hazırlayın ve test gününde yaklaşık 5 x 105 hücre / mL elde edin.
not: Test gününde 4-6 x 105 hücre / mL bulunduğundan emin olun.
3. Fagositoz testi (Şekil 2)
- Tahlile başlamadan önce, PBS'de steril% 2 FBS kuyusu başına 150 μL kullanarak iki yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakayı (biri opsonizasyon ve diğeri fagositoz için) bloke edin ><(>1 saat).
not: Plaka 1'i bir opsonizasyon plakası olarak etiketleyin ve hem etidyum bromür (EtBr) boyama hem de opsonizasyon için kullanın. Plaka 2'yi fagositoz plakası olarak etiketleyin ve hem THP-1 hücre kaplaması hem de fagositoz adımı için kullanın.
- Parazit boyama ve opsonizasyon
- 1.6'da hazırlanan IE süspansiyonunu alın ve 2.5 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için parazit kültürü ortamı ve etidyum bromür (EtBr) ekleyerek hücre sayısını 3.3 x 107 IEs/mL'ye ayarlayın (0.1 mg/mL stoktan 1:40 seyreltme).
not: EtBr, parazit DNA'sını boyayarak akış sitometrisi ile tespit edilmesini sağlar.
Dikkat: EtBr bir mutajen ve cilt, göz ve solunum yolu tahriş edicidir. Uygun koruma kullanın ve atıkları yerel yönetmeliklere göre atın.
- Blokaj solüsyonunu 96 oyuklu plakadan (opsonizasyon plakası) çıkarın, plakayı hafifçe vurun ve bir parça havlu kağıdı üzerindeki sıvı fazlalığını çıkarın.
- Plakanın üst yarısında yukarıda hazırlanan IE süspansiyonunun oyuğu başına 30 μL ekleyin. Bir kuyuyu boş bırakın ve 30 μL parazit kültürü ortamı ekleyin (tek başına THP-1 kontrolü için IE'ler olmadan). (Şekil 3A). Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve ışıktan koruyun.
- Parazit kültürü ortamının oyuğu başına 170 μL ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 500 x g'da döndürün ve plakayı uygun bir atık kabının üzerine hafifçe vurarak süpernatanı çıkarın.
- EtBr etiketli IE'leri, parazit kültürü ortamının oyuğu başına 200 μL kullanarak iki kez daha yıkayın ve plakayı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. İlk yıkamadan çıkan süpernatant, plakaya hafifçe vurularak çıkarılabilir. Yıkama ortamının tüm hacminin çıkarıldığından emin olmak için çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanı ikinci yıkamadan dikkatlice çıkarın. Peletleri rahatsız etmeyin.
- EtBr etiketli IE'leri bir parazit kültür ortamında istenen konsantrasyonlarda hazırlanan 30 μL antikor / plazma / serum çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
- Her zaman aşağıdaki kontrolleri ekleyin (Şekil 3B): IE'ler / THP-1 hücreleri kontrolü olmayan bir kontrol (parazit kültür ortamı); herhangi bir antikor veya plazma / serum içermeyen bir kontrol (opsonize edilmemiş kontrol); 1: 100 seyreltmede ticari olarak temin edilebilen tavşan anti-insan eritrosit antikorunu kullanan pozitif bir kontrol (bkz.); 1: 5 seyreltmede iki negatif plazma / serum kontrolü (sıtmaya maruz kalmayan bir havuz ve sıtmaya maruz kalan erkeklerden bir havuz); ve 1: 5 seyreltmede pozitif bir serum kontrolü (daha önce hamile kalmış sıtmaya maruz kadınlardan bir havuz (tercihen multigravidae)).
not: Pozitif kontrol için 1:100'lük bir seyreltme, satın alınan antikorların farklı partilerinde tutarlı bir şekilde çalışıyor gibi görünmektedir (veriler gösterilmemiştir). Bununla birlikte, her yeni antikor partisi kullanıldığında birkaç seyreltmeyi test ederek partiler arasındaki varyasyonları ekarte etmeniz önerilir.
- Karanlıkta 37 °C'de 45 dakika inkübe edin.
- THP-1 hücrelerinin hazırlanması ve fagositoz
- IE'ler opsonize edilirken (3.2.8), THP-1 hücrelerini hazırlamaya başlayın.
- THP-1 hücrelerini kültür şişesinden çıkarın, döndürün (oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g), süpernatanı boşaltın ve peleti THP-1 hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.
- Tekrar döndürün (oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g), süpernatanı boşaltın ve hücre peletini 1 mL THP-1 hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin.
- Yukarıda hazırlanan çözeltideki hücre sayısını belirleyin ve 5 x 105 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için daha fazla ortam ekleyin.
- Plakayı hafifçe vurarak ve bir parça havlu kağıdı üzerindeki sıvı fazlalığını çıkararak kalan 96 oyuklu plakadan (fagositoz plakası) bloke edici çözeltiyi çıkarın.
- 3.3.4'te hazırlanan THP-1 hücre süspansiyonunun oyuğu başına 100 μL ekleyin ve hücre kültürü inkübatörüne geri koyun (Şekil 3C).
- Antikor / plazma / serum inkübasyon süresi bittiğinde, parazit kültürü ortamının oyuğu başına 170 μL ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 500 x g'da döndürün ve plakayı uygun bir atık kabının üzerine hafifçe vurarak süpernatanı çıkarın.
- Opsonize IE'leri, parazit kültürü ortamının kuyusu başına 200 μL kullanarak iki kez daha yıkayın ve plakayı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. İlk yıkamadan çıkan süpernatant, plakaya hafifçe vurularak çıkarılabilir. Tüm yıkama ortamı hacminin çıkarıldığından emin olmak için çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanı ikinci yıkamadan dikkatlice çıkarın. Peletleri rahatsız etmeyin.
- Son olarak, opsonize IE'leri 100 μL önceden ısıtılmış THP-1 hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın. Fagositoz plakasındaki her bir oyuğa 50 μL opsonize IE süspansiyonu aktarın. Toplam 100 μL IE olduğundan, her antikor/serum seyreltmesi fagositoz plakasında çift olarak çalıştırılabilir (Şekil 3D)
not: Tahlilde kullanılan IE'lerin ve THP-1 hücrelerinin miktarı 10: 1 oranına karşılık gelir.
- Karanlıkta 37 °C, %5 karbondioksit (CO2) sıcaklıkta 40 dakika inkübe edin.
not: Fagositozun 40 dakikadan fazla ilerlemesine izin vermeyin.
- 4 ° C'de (500 x g, 5 dakika) santrifüjleme ile fagositozu durdurun ve plakayı hafifçe vurarak süpernatanı atın. 150 μL oda sıcaklığında amonyum klorür parçalama çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın, tam olarak 3 dakika inkübe edin
not: Bu adım, THP-1 hücreleri tarafından fagosite edilmemiş eritrositleri parçalayacaktır.
- PBS'ye 100 μL buz gibi %2 FBS ekleyerek lizisi durdurun. Plakayı 4 °C'de (3 dakika boyunca 500 x g) döndürün ve plakayı uygun bir atık kabının üzerine hafifçe vurarak süpernatanı çıkarın.
- PBS'de buz gibi soğuk% 2 FBS kuyusu başına 200 μL kullanarak üç kez yıkayın, plakayı 4 ° C'de döndürün (3 dakika boyunca 500 x g). Son yıkamadan sonra, PBS'de 200 μL buz gibi% 2 FBS'de tekrar süspanse edin ve hemen akış sitometrisi ile analiz edin.
not: Önceki yayınlar, akış sitometrisi31'den önce% 2 paraformaldehitte hücre fiksasyonunu kullanmıştır, ancak burada sunulan sonuçlar, tahlil tamamlandıktan hemen sonra elde edilmiştir. Plakayı 4°C'de saklayarak akış sitometrisi veri alımının ertelenmesi önerilmez, çünkü EtBr + THP-1 hücrelerinin yüzdesi hızla bozulur (Şekil 4).
4. Akış sitometrisi edinimi ve analizi
NOT: 96 oyuklu plaka formatını destekleyen ve EtBr floresansını ölçmek için uygun lazerlere/filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi kullanılabilir.
- Edinme için, hiçbir IE'nin eklenmediği kuyuları kullanarak doğrusal ileri saçılma (FSC) ve doğrusal yan saçılma (SSC) grafiği kullanarak THP-1 hücrelerine geçit yapın (Şekil 2A) ve bu geçit üzerinde 10.000 olay elde edin.
- Bir histogram grafiği kullanarak THP-3 kapısındaki EtBr (FL1-Log) için floresan yoğunluğunu ölçün.
- Geçit için, önce hiçbir IE'nin eklenmediği kuyuları kullanarak, bir FSC ve SSC yoğunluk grafiğinde THP-1 hücrelerine geçit (Şekil 5A). Ardından, THP-3 hücrelerini (IE eklenmemiş) ve opsonize edilmemiş kontrolü kullanarak bir FL1 (EtBr) histogramında pozitif bir kapı ayarlayın (Şekil 5B).
- Bu kapıları aynı plakada test edilen diğer tüm numunelerde kopyalayın ve EtBr pozitif THP-1 hücrelerinin yüzdesini belirleyin (en az bir IE fagositize olan THP-1 hücreleri). Test edilen örneklerin her biri için fagositoz, mutlak değerler (EtBr + THP-1 hücrelerinin yüzdesi) veya maksimum pozitif kontrol kullanılarak yüzde olarak hesaplanan bağıl fagositoz olarak rapor edilebilir.
