>NOT: Aşağıdaki protokoller, numune hazırlamayı ve nötrofil serin proteazlar (NSP'ler) aktivitesinin miktar tayinini açıklar. Burada sunulan deneysel prosedürler, insan balgam ve nötrofil elastaz (NE) veya katepsin G (CG) aktivitesi ölçümüne odaklanmaktadır. Bununla birlikte, numune hazırlama protokolündeki küçük uyarlamalar, kan kaynaklı hücrelerin ve tümör homojenatlarının analizini mümkün kılar. Ek olarak, matriks metalloproteinaz ve katepsin S aktiviteleri, özel FRET probları aracılığıyla benzer şekilde araştırılabilir
1. Numune hazırlama: hücre izolasyonu ve süpernatan ayırma
NOT: Mümkünse, balgam tedavisi balgam söktürücülükten sonraki 120 dakika içinde yapılmalı ve balgam daha sonraki işlemlere kadar buz üzerinde saklanmalıdır.
- Balgamın kendiliğinden balgam çıkarması mümkün değilse, daha önce tarif edildiği gibi balgamı indükleyin. Kısaca, balgam indüksiyon işlemine başlamadan önce 200 μg β-2-reseptör-antagonisti salbutamol solutun. Daha sonra, bir nebülizör kullanarak 15 dakika boyunca hipertonik (% 6) bir tuzlu su solüsyonu soluyun. Balgam söktürücü balgamı bir Petri kabında toplayın.
- Mukus kümelerini tükürükten bir pipet ucu yardımıyla bir Petri kabına ayırın.
- Mukusu tartın.
not: Bir mukus örneğinin ortalama ağırlığı 0,8 g'dır (0,1 g ile 5 g arasında değişir); Bahsedilen prosedürleri gerçekleştirmek için genellikle 0,1 g yeterlidir.
- Balgama 4 kısım (h/a)% 10 Sputolysin (PBS'de) ekleyin (örneğin, her gram balgam için 4 mL% 10 Sputolysin).
Dikkat: Sputolysin, fosfat tamponunda konsantre ditiotreitolden oluşur, bu nedenle dikkatli kullanın.
- Mukusu çözmek için karışımı oda sıcaklığında (RT) sallanan bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin. Güvenlik nedeniyle, çalkalayıcıyı bir çeker ocak içine yerleştirin.
- Aynı hacimde soğuk PBS ekleyerek reaksiyonu söndürün (örneğin: her mL% 10 Sputolysin için 1 mL soğuk PBS).
- Homojen bir çözelti elde etmek için pipetleme ile karıştırın.
- Karışımı 100 μm'lik bir naylon hücre süzgecinden 50 mL'lik bir tüpe süzün.
- Filtrasyon adımını 40 μm'lik bir naylon hücre süzgecinden geçirin.
- Çözeltiyi 4 ° C'de 300 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatan fraksiyonu dikkatlice yeni bir tüpe aktarın ve buz üzerinde saklayın.
not: Süpernatan fraksiyonlar, daha fazla analize kadar -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir.
- Hücre peletini 500 μL soğuk PBS'de nazikçe yeniden süspanse edin ve buzun üzerine yerleştirin.
not: Hücre fraksiyonu hemen işlenmelidir.
2. Nötrofil serin proteaz aktivitesi ölçümü
>NOT: Burada, FRET raportörleri aracılığıyla NSP'nin aktivitesini ölçmek için farklı yöntemler tanıtılmaktadır. Teknolojinin seçimi, spesifik biyomedikal soru ve deneyin amacı tarafından belirlenir. Sunulan problar, akciğerle ilgili bir dizi enzime karşı özgüllükleri açısından kapsamlı bir şekilde test edildi. Problar hedef enzimlerine özgü olsa da, her zaman ilgilenilen klinik numune üzerindeki prob özgüllüğünü kontrol edin. Bu, prob ilavesinden önce numunenin spesifik bir proteaz inhibitörü ile inkübe edilmesiyle elde edilebilir, bu da verici/alıcı (D/A) oranındaki herhangi bir artışı ortadan kaldırmalıdır.
- Çözünür NSP'nin florimetre veya plaka okuyucu testi ile aktivite miktar tayini
not: Numunenin çözünür fraksiyonlarındaki proteaz aktivitesi, floresan tespiti yapabilen herhangi bir aletle tespit edilebilir.
- Enzimleri buz üzerinde çözdürün.
- Kullanana kadar, kendi kendine bölünmeyi önlemek için NE ve CG'yi asidik bir depolama tamponunda (50 mM sodyum asetat, 200 mM NaCl, pH 5.5) tutun.
- Bir enzim standart eğrisi oluşturmak için, aktivasyon tamponunda (10 mM Tris-HCl, pH 7.5'te 500 mM NaCl) enzimin 1: 2 seri seyreltmesini (NE için 33.9 - 0.271 nM; CG için 42.6 - 0.333 nM) hazırlayın. Aktivasyon tamponu nötr bir pH'a sahiptir ve bu nedenle enzimatik katalizin verimli bir şekilde gerçekleşmesini sağlar.
- En yüksek standart konsantrasyonu (NE konsantrasyonu: 33.9 nM) hazırlamak için, 1 μL NE'yi (33.9 μM) 999 μL aktivasyon tamponunda seyreltin.
- İkinci standardı hazırlamak için (NE konsantrasyonu: 16.95 nM), ilk seyreltmenin 200 μL'sini 200 μL aktivasyon tamponu ile karıştırın.
- Kalan 1:2 seyreltmeleri hazırlamak için buna göre ilerleyin.
- Boş olan son standart, saf bir aktivasyon tamponundan oluşur. Teknik kopyaların veya üçlülerin ölçülmesi önerilir. Standart ve numune hazırlama sırasında, şişeleri buz üzerinde tutmaya çalışın.
- Standart hazırlığa paralel olarak, balgam örneklerini bir aktivasyon tamponunda seyreltin. Raportör sinyalinin doğrusal artış aralığında (D/A oranı) kalmak için proteaz aktivitelerini değerlendirmeden önce insan örneklerini seyreltin. Hasta numuneleri seyreltilmeden bırakılırsa, güvenilir bir uygulama için bölünme çok hızlı gerçekleşir. Sağlıklı donör balgam, kistik fibrozis (KF) ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) hastalarından alınan örneklere kıyasla daha az aktif proteaz içerdiğinden, genellikle farklı dilüsyonlar yapılır (sağlıklı balgam süpernatanı için 1:10, KOAH veya KF hastalarının balgam süpernatanı için 1:20-500).
not: Konsantrasyonlarının bilinmediği numunelerde proteaz aktivitesini kantitatif olarak ölçmek için, bilinen enzim konsantrasyonlarına sahip standart bir eğrinin paralel olarak, ideal olarak aynı plaka üzerinde ölçülmesi gerekir. İnsan balgamındaki aktif enzim konsantrasyonu, insan balgam örneklerinde ölçülen eğimlerin standart eğrilerle ölçülen eğimlerle enterpolasyonu yoluyla hesaplanır.
- Numuneleri ölçüm için hazırlamadan önce cihazı kurun. NE Förster rezonans enerji transferi tabanlı (FRET) prob (NEmo-1) için uyarma dalga boyunu 354 nm'ye ayarlayın ve algılama dalga boyunu verici için 400 nm'ye ve alıcı için 490 nm'ye ayarlayın. CG FRET probu (sSAM) için uyarma dalga boyunu 405 nm'ye ayarlayın ve emisyonu 485 (verici) ve 580 nm'ye (alıcı) ayarlayın.
- Siyah 96 oyuklu yarım alan plakasının kuyucuklarına standart veya boş 40 μL numune ekleyin.
- Raportörleri içeren ana karışımı hazırlamak için (raportörün ana karışımdaki konsantrasyonu: 10 μM), prob stoğunu (dimetilsülfoksit, DMSO içinde 1 mM) aktivasyon tamponunda 1:100 oranında seyreltin. 10 μL x gerekli plaka kuyusu sayısını çarparak gerekli ana karışım hacmini hazırlayın. NEmo-1 ve sSAM raportörlerinin floresan ölçümü için optimum nihai konsantrasyona (2 μM) ulaşmak için, her bir kuyucuğa 10 μL ana karışım ekleyin (standart veya boş 40 μL numune içeren) ve okumayı başlatın. NEmo-1 ve sSAM raportörleri bu nedenle sırasıyla çözünür nötrofil elastaz ve katepsin G aktivitesini izleyecektir.
not: Bir reaktif enjektörü mevcut değilse, raportör numunelere ekledikten sonra mümkün olan en kısa sürede okumaya başladığınızdan emin olun.
- Plaka okuyucu ölçümünü başlatın ve en az 20 dakika boyunca veya sinyaldeki artış bir platoya ulaşana kadar her 60-90 saniyede bir D/A oranı artışını kaydedin.
- Veriler dışa aktarıldıktan sonra, her bir zaman noktası ve numune için donör bağıl floresan birimlerini (RFU) alıcı RFU'ya bölerek D/A oranını hesaplayın.
- Her numunenin D/A oranını, ortalamasını ve standart sapmasını hesaplayın.
- D/A oranı değişiminin doğrusal büyümesi içindeki eğimi belirleyin. Eğim, bir FRET probu için enzim bölünme hızının bir göstergesidir. İnsan örneklerinden elde edilen doğrusal regresyon eğimlerini enzim standardından hesaplananlarla eşleştirerek balgamdaki aktif enzim konsantrasyonunu hesaplayın.
