$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Mikroakışkan cihaz hazırlığı.
- Mikroakışkan Hücre Migrasyon Testi Hazırlığı
- Bir biyogüvenlik kabini içinde 50 μL stok fibronektin solüsyonunu (1 mg / mL) 950 μL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (DPBS) seyrelterek 50 μg / mL fibronektin çözeltisi hazırlayın.
- 9 mL Roswell Park Memorial Institute besiyerini (RPMI-1640) ve 1 mL RPMI-1640'ı% 4 sığır serum albümini (BSA) ile karıştırarak migrasyon ortamını hazırlayın.
- Deiyonize suyu cihazdan çıkarın.
- Çıkıştan cihaza 100 μL fibronektin solüsyonu ekleyin. Tüm kanalların fibronektin solüsyonu ile doldurulduğundan emin olmak için 3 dakika bekleyin. Mikroakışkan cihazı oda sıcaklığında 1 saat boyunca kapalı bir Petri kabına yerleştirin.
- Fibronektin çözeltisini cihazdan çıkarın. Prizden 100 μL migrasyon ortamı ekleyin. Tüm kanalların geçiş ortamıyla doldurulduğundan emin olmak için 3 dakika bekleyin.
- Cihazı oda sıcaklığında 1 saat daha inkübe edin; cihaz daha sonra kemotaksis deneyi için hazırdır.
- Kemotaksis deneyi için kemoatraksan çözelti hazırlama.
- Toplam 1 mL migrasyon ortamında 100 nM fMLP çözeltisi hazırlayın. 5 μL stok FITC-Dextran'ı (10 kDa, 1 mM) 1.5 mL'lik bir tüpte fMLP çözeltisi ile karıştırın.
not: Gradyan ölçümü için FITC-Dextran kullanılır. Alternatif olarak, gradyan göstergesi olarak Rhodamine'i kullanın. fMLP kemoatraktan çözeltisi daha sonra kemotaksis deneyi için hazırdır.
- Balgam örneği hazırlama.
not: KOAH hastalarından alınan balgam örneklerinin bir gradyanı tarafından indüklenen nötrofil kemotaksisi, bu hepsi çip üzerinde yöntemin klinik bir tanı uygulaması olarak test edildi.
- KOAH hastalarından balgam örnekleri toplamak için bir insan etiği protokolü edinin.
not: Winnipeg'deki Seven Oaks General Hospital'da (Manitoba Üniversitesi tarafından onaylanmış) numune toplamak için onay aldık.
- Tüm deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam formlarını alın.
- KOAH hastalarının spontan balgam örneklerini toplayın. 500 μL balgam örneğini 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
- 1,5 mL'lik tüpe 500 μL %0,1 ditiyotreitol ekleyin ve hafifçe karıştırın. Tüpü 15 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin.
- Numuneyi 753 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı toplayın. Süpernatanı 865 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve ardından son süpernatanı toplayın. Toplanan süpernatanı kullanmadan önce -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
- Kemotaksis deneyi için hazır olduğunda, balgam çözeltisini çözün; 900 μL migrasyon ortamını 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve bir biyogüvenlik kabini içinde 100 μL balgam çözeltisi ile karıştırın; balgam çözeltisi daha sonra kemotaksis deneyi için hazırdır.
- Kan örneği toplama.
- Sağlıklı bağışçılardan kan örnekleri toplamak için bir insan etiği protokolü edinin. Tüm kan bağışçılarından bilgilendirilmiş yazılı onam formlarını alın.
not: Burada örnekler Winnipeg'deki Victoria Genel Hastanesi'nde elde edildi (Manitoba Üniversitesi'ndeki Ortak Fakülte Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı).
- Kan örneğini damar delinmesi ile toplayın ve örneği EDTA kaplı bir tüpe koyun. Deneyden önce tüpü bir biyogüvenlik kabininde saklayın.
2. Hepsi Çip Üzerinde Kemotaksis Test Çalışması
- Çip üzerinde hücre izolasyonu (Şekil 1B).
- 10 μL tam kanı bir biyogüvenlik kabini içindeki 1,5 mL'lik bir tüpe koyun.
not: Kan örneği alımı ile ilgili detaylar bölüm 1.4'te yer almaktadır.
- Nötrofil izolasyon kitinden 2 μL antikor kokteyli (Ab) ve 2 μL manyetik parçacık (MP) 1.5 mL'lik tüpe ekleyin ve yavaşça karıştırın; bu, nötrofiller hariç kandaki hücreleri işaretleyecektir.
- Kan-Ab-MP karışımını oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
not: Bu, kandaki antikor etiketli hücreleri manyetik olarak etiketleyecektir.
- Cihazın hücre yükleme portunun iki tarafına iki küçük manyetik disk takın. Ortamı cihazın tüm bağlantı noktalarından aspire edin.
- 2 μL kan-Ab-MP karışımını hücre yükleme portundan mikroakışkan cihaza yavaşça pipetleyin.
NOT: Manyetik olarak etiketlenmiş hücreler, hücre yükleme portunun yan duvarlarına hapsedilirken, nötrofiller cihaza akar ve hücre yerleştirme yapısında sıkışır.
- Hücre yerleştirme alanında yeterli sayıda nötrofil sıkışana kadar birkaç dakika bekleyin.
3. Kemotaksis deneyi (Şekil 1C).
- Mikroakışkan cihazı 37 °C'de sıcaklık kontrollü mikroskop aşamasına yerleştirin.
- 100 μL kemoatraktan çözeltisi (fMLP veya balgam çözeltisi) ve 100 μL migrasyon ortamını iki pipetleyici kullanarak belirlenen giriş rezervuarlarına ekleyin; bu, bir basınç dengeleme yapısı tarafından desteklenen sürekli laminer akış bazlı kimyasal karıştırma ile gradyan kanalında bir kemoatraktan gradyan gradyanı oluşturacaktır.
not: KOAH hastalarından balgam çıkarma detayları bölüm 1.3'te yer almaktadır.
- Orta kontrol deneyi için, her iki giriş rezervuarına yalnızca migrasyon ortamı ekleyin.
- Degrade kanalında FITC-Dextran'ın floresan görüntüsünü elde edin.
- "Dosya|Açık".
- "Analyze |Arsa Profili".
- Daha fazla çizim için ölçüm verilerini bir elektronik tabloya aktarın.
- Cihazı sıcaklık kontrollü mikroskop aşamasında veya geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe 15 dakika inkübe edin.
- Veri analizi için hücrelerin son konumlarını kaydetmek için 10X'lik bir hedef kullanarak gradyan kanalını görüntüleyin.
- Gerekirse, hızlandırılmış mikroskopi ile cihazdaki hücre göçünü kaydedin.
4. Hücre Migrasyonu Veri Analizi (Şekil 1C)
- Aşağıda açıklandığı gibi yerleştirme yapısından hücre göç mesafesini hesaplayarak kemotaksis testini analiz edin. Şekil 1C'ye bakın.
- Görüntüyü NIH ImageJ yazılımına aktarın (sürüm 1.45).
- Degrade kanalına taşınan her hücrenin merkezini seçin.
- Seçilen hücrelerin son konumları için koordinatlarını ölçün. Yerleştirme yapısının kenarındaki bir noktanın koordinatını ilk referans konumu olarak ölçün.
- Ölçülen koordinat verilerini elektronik tablo yazılımına (ör. Excel) aktarın. Hücrelerin göç mesafesini, bir hücrenin son konumu ile gradyan yönü boyunca ilk referans konumu arasındaki fark olarak hesaplayın.
- Bir mikrometreye olan mesafeyi kalibre edin. Kemotaksisin bir ölçüsü olarak tüm hücrelerin göç mesafesinin ortalamasını ve sapmasını hesaplayın.
- Bir kemoatraktan gradyan varlığında migrasyon mesafesini, Student'ın t-testini kullanarak orta kontrol deneyi ile karşılaştırın.
- Hücre göçünün hızlandırılmış görüntüleri kaydedilirse, hücre göçü ve kemotaksisi, hücre izleme analizi ile daha fazla analiz edilebilir.
not: Hepsi üzerinde çip kemotaksisi testini oluşturmak ve gerçekleştirmek için gereken malzemeler, malzeme tablosunda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
