1. Çekirdeklerinde kırmızı floresan proteini eksprese eden hedef hücrelerin hazırlanması
- Uygun bir kaynaktan hedef fare kanseri hücre hattı elde edin.
not: Bu protokolde, E0771 fare meme tümör hücrelerinin (E0771-LG) oldukça metastatik bir türevi kullanılır. Ebeveyn E0771 hücreleri C57BL/6 farelerinden kaynaklanır.
- 37 ° C,% 95 nem ve% 5 CO 2.
bir hücre kültürü inkübatöründe% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) dahil olmak üzere Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium (DMEM) ile bir E0771-LG hücresi şişesini çözün ve koruyun
not: Hücrelerin mikoplazma için negatif olduğu doğrulanmalıdır. Bu amaçla, E0771 hücrelerini (veya test edilecek hücreleri) yukarıda tarif edildiği gibi 2-3 gün boyunca (antibiyotik ve antimikotik yokluğunda) kültürleyin ve 500 μL kültür ortamı toplayın. Hücre kalıntılarını ortadan kaldırmak ve süpernatanı yeni tüplere aktarmak için ortamı 60 saniye boyunca 12.419 x g'da santrifüjleyin. Ticari olarak temin edilebilen bir mikoplazma test kiti (Malzeme Tablosuna bakın) ve/veya üreticinin talimatlarını izleyerek PCR kullanarak mikoplazma kontaminasyonunu belirleyin.
- 5 x 103 E0771-LG hücresini 12 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve hücreleri gece boyunca 37 ° C,% 95 nem ve% 5 CO2.
not: Hedef hücrelerin çoğalma hızı düşükse (popülasyon iki katına çıkma süresi 36 saatten fazla), hücre sayısı 1 x 10'a yükseltilebilir4.
- Ortamı 10 μg/mL polibren içeren 1 mL %10 (h/h) FBS-DMEM ile değiştirin ve nükleer kısıtlı kırmızı floresan proteini kodlayan 25 μL lentiviral partikül (1 x 106 TU/mL) ekleyin (mKate2, Malzeme Tablosuna bakın).
- Hücreleri 37 ° C,% 95 nem ve% 5 CO2'de bir inkübatörde 24 saat boyunca kültürleyin.
- Ortamı %10 (h/h) FBS-DMEM ile değiştirin ve hücreleri 37 ° C, %95 nem ve% 5 CO2'de bir inkübatörde 24-48 saat kültürleyin.
- Hücreler kırmızı bir floresan proteini eksprese etmeye başladığında ortamı 1 μg/mL puromisin içeren %10 (h/h) FBS-DMEM ile değiştirin ve hücreleri %80-90 birleşene kadar kültürleyin.
not: Puromisin konsantrasyonu, hedef hücre tipleri arasında farklı olacaktır ve transfekte edilmemiş hücreler kullanılarak optimize edilmelidir.
- 1 μg/mL puromisin dahil olmak üzere% 10 (h / v) FBS-DMEM ile 1-3 geçiş için hayatta kalan hücreleri alt kültürleyin ve kullanıma kadar sıvı nitrojen buharı fazı depolama sisteminde kriyoprezervasyon stoklarını alt kültürleyin.
2. Farelerde baskılayıcı hücrelerin tümörlerden izolasyonu
NOT: Bu protokolde, baskılayıcı hücreler (yani metastaz ile ilişkili makrofajlar (MAM'lar) ve monositik-miyeloid türevli baskılayıcı hücreler (M-MDSC'ler)), E0771-LG hücreleri tarafından oluşturulan metastatik tümörleri içeren akciğerden izole edilir. Doku ayrışması ve hücre sınıflandırma koşulları, hücreleri farklı dokulardan izole etmek için optimize edilmelidir.
- 1 x 106 kanser hücresi (E0771-LG) sinjeneik (C57BL / 6), dişi, 7-10 haftalık farelerin kuyruk damarına enjekte edin.
- 14 gün sonra, metastatik tümörler içeren akciğeri izole edin ve daha önce tarif edildiği gibi enzimatik sindirim yoluyla perfüze akciğerlerden tek hücreli süspansiyonlar hazırlayın.
not: Bu protokolde, dört fareye kanser hücreleri enjekte edilir ve metastatik akciğerleri birleştirilerek yeterli baskılayıcı hücreler elde edilir.
- Tek hücreli süspansiyonları anti-fare CD16 / CD32 antikoru ile buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve CD45, F4 / 80, CD11b, Ly6C ve Ly6G'ye floresan antikorlarla boyanmış (Malzeme Tablosuna bakın) 30 dakika daha.
- Lekeli hücreleri bir kez% 2 (a / h) sığır serum albümini (BSA) içeren 1 mL PBS ile yıkayın ve hücre peletini% 2 (a / h) BSA içeren 500-1000 μL PBS ile yeniden süspanse edin.
- 3 μM DAPI ekleyin ve M-MDSC'leri (DAPI–CD45+F4/80+Ly6G–CD11byüksekLy6Cyüksek) ve MAM'ları (DAPI–CD45+F4/80+Ly6G–CD11byüksekLy6Cdüşük) bir hücre sıralayıcı kullanarak sıralayın (Şekil 1).
not: MAM'ları (Ly6Clow) ve M-MDSC'leri (Ly6Chigh) ayırt etmek için Ly6C seviyesinin eşiği, yerleşik alveolar makrofajlarınkine (RMAC) dayanmaktadır. Sıralanan hücrelerin saflığı, beklenen saflık oranı %90'dan fazla olan akış sitometrisi ile ölçülür.
- Sıralanan hücreleri %20 (h/h) FBS, %1 (h/h) penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin, %1 (h/h) esansiyel olmayan amino asit, 1 mM sodyum piruvat ve 50 nM 2-merkaptoetanol (zenginleştirilmiş-DMEM, E-DMEM olarak adlandırılır) içeren 400 μL DMEM ile yeniden süspanse edin.
- Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın ve E-DMEM ile 2 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın.
- Hücreleri kullanana kadar buz üzerinde tutun.
3. Farelerin dalağından CD8+ T hücrelerinin izolasyonu
- Dalağı, hedef kanser hücre hattına sinjenik olan bir fareden (yani, bu protokoldeki C57BL / 6 fareler) aşağıdaki gibi izole edin:
- Hayvanı CO2 soluma ile ötenazi yapın.
- Hayvanı temiz bir diseksiyon tahtasına yerleştirin ve cildi %70 (h/h) etanol ile silin.
- Dalağı ortaya çıkarmak için karın derisini makas kullanarak kesin
- Midenin alt kısmında bulunan dalağı izole edin ve 5 mL buz gibi soğuk PBS içeren bir tüpe yerleştirin.
- Steril 5 mL'lik bir şırınganın iç pistonunu kullanarak, dalağı 50 mL'lik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 100 μm'lik bir hücre süzgeci üzerinde öğütün.
- Toplam 10 mL PBS kullanarak hücreleri filtreden geçirin.
- Hücre süspansiyonunu 337 x g'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
- Hücre peletini 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve% 0.5 (a / h) BSA (çalışma tamponu) içeren 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
- Canlı hücre sayısını sayın ve çalışan arabelleği kullanarak 1 x 108 hücre/mL'ye ayarlayın.
not: Saflık kontrolü için ön zenginleştirme numunesi olarak küçük bir hücre alikotu bulundurun.
- Negatif bir seçim kiti ve manyetik bir sıralayıcı kullanarak CD8+ T hücreleri için zenginleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
- Splenosit hücrelerinin 1 x 108'ini (1 mL) 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
- 50 μL biyotinile antikor ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- 125 μL streptavidin konjuge manyetik boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 1.325 mL çalışma tamponu ekleyin ve pipetleyerek hafifçe karıştırın.
- Tüpü mıknatısın içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 2,5 dakika inkübe edin.
- Mıknatısı alın ve zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunu yeni bir tüpe dökün.
- Zenginleştirilmiş hücreleri 200 μL E-DMEM ile yeniden süspanse edin (ör.% 20 (h / v) FBS,% 1 (h / v) penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamin,% 1 (h / h) esansiyel olmayan amino asit, 1 mM sodyum piruvat ve 50 nM 2-merkaptoetanol).
- Canlı hücrelerin sayısını sayın ve E-DMEM ile 2 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın. Hücreleri kullanıma kadar bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de tutun.
not: Saflık kontrolü için zenginleştirme sonrası numune olarak küçük bir hücre alikotu bulundurun.
- CD8 + T hücrelerinin saflığını akış sitometrisi ile aşağıdaki gibi belirleyin:
- Zenginleştirme öncesi (adım 3.6) veya zenginleştirme sonrası (adım 3.9) örneklerden 1 x 104 hücre alın ve çalışan bir tampon kullanarak her birinin toplam hacmini 100 μL'ye ayarlayın.
- Tek hücreli süspansiyonları anti-fare CD16 / CD32 antikoru ile buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve 30 dakika daha CD45, CD3, CD4 ve CD8'e (Malzeme Tablosuna bakın) floresan antikorlarla boyayın.
- Lekeli hücreleri %2 (a/a) BSA içeren 500 μL PBS ile yıkayın ve hücre peletini %2 (a/h) BSA içeren 500-1000 μL PBS ile yeniden süspanse edin.
- 3 μM 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin ve toplam CD45 + hücre popülasyonundaki CD3 + CD4-CD8 + hücrelerinin yüzdesini belirleyin.
4. İzole edilmiş CD8+ T hücrelerinin aktivasyonu ve genişlemesi
- 50 μL CD8 + T hücresi başına 1 x 105 hücre (adım 3.9'da hazırlanmıştır) U-tabanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına alikot.
- Kuyucuklara 50 μL baskılayıcı hücre başına 1 x10 5 hücre (adım 2.7'de hazırlanır) veya 50 μL E-DMEM ekleyin.
- E-DMEM, 4 x 104 U/mL koloni uyarıcı faktör 1 (BOS-1), 240 U/mL interlökin-2 (IL-2), 8 μg/mL anti-fare CD3ε antikoru ve 16 μg/mL anti-fare CD28 antikorundan oluşan aktivasyon ortamı hazırlayın.
not: BOS-1, T hücresi aktivasyonu için gerekli değildir, ancak bu protokoldeki baskılayıcı hücrelerin hayatta kalması için gereklidir (ör., MAM'lar ve M-MDSC'ler). Böylece, kültür koşullarında tutarlılığı korumak için T hücrelerinin hedef kanser hücreleri ile ko-kültüründe tutulur. CSF-1, tüm dokularda nano-molar konsantrasyonlarda bulunduğundan ve in vivo olarak monosit / makrofaj canlılığı için gerekli olduğundan, bu, bu hücreler için fizyolojik bir bağlamdır.
- Test edilecek reaktifler olsun veya olmasın 50 μL aktivasyon ortamı (adım 4.3) ve 50 μL E-DMEM ekleyin.
- Plakayı 37 °C, %95 nem ve %5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin ve hücreleri 4 gün boyunca kültürleyin.
5. Önceden aktive edilmiş CD8+ T hücreleri ile hedef hücrelerin ko-kültürünün kurulması
- Mikroskopiye uygun düz tabanlı 96 oyuklu plakanın kuyucuklarına 30 μL 1:100 seyreltilmiş büyüme faktörü azaltılmış çözünür bazal membran matrisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve 37 ° C'de bir CO2 inkübatörde en az 1 saat inkübe edin.
- Hedef hücreleri hazırlayın (yani, nükleer kısıtlı kırmızı floresan proteini ifade eden E0771-LG hücreleri).
- Hedef hücreleri oda sıcaklığında 1 mL %0.05 tripsin/EDTA ile 1 dakika inkübe edin ve hücreleri nazikçe pipetleme ile hasat edin.
- % 10 (h / v) FBS dahil olmak üzere 9 mL DMEM ekleyin ve hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 337 x g'da santrifüjleyin.
- Hücreleri 500 μL E-DMEM ile yeniden süspanse edin ve canlı hücre sayısını sayın.
not: Hedef hücreleri saymadan önce, tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için hücreleri 40μm'lik bir hücre süzgecinden süzün .
- E-DMEM ekleyerek yoğunluğu 2 x 104 hücre/mL (= 1 μL'de 103 hücre) olarak ayarlayın ve hücreleri buz üzerinde tutun.
- Efektör hücreleri hazırlayın (ör., önceden aktive edilmiş CD8 + T hücreleri).
- Hücreleri 96 oyuklu bir plakanın (adım 4.5) bir kuyucuğunda pipetleme ile iyice yeniden süspanse edin ve yüzen CD8 + T hücrelerini yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın.
not: MAM'lar ve M-MDSC'ler kuyuya sıkıca yapışır ve pipetleme tarafından ayrılmaz.
- Kalan hücreleri toplamak için, kuyucuğa 200 μL PBS ekleyin ve adım 5.3.1'de tüpe aktarın.
- Hücreleri 1 mL E-DMEM ile bir kez yıkayın (337 x g'da santrifüj) 5 dakika, süpernatanı aspire edin ve atın) ve 100 μL E-DMEM ile tekrar süspanse edin.
- Canlı hücrelerin sayısını sayın (tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak), yoğunluğu 1.6 x 105 hücre / mL (= 4 x 103 hücre / 25 μL) olarak ayarlayın ve hücreleri buz üzerinde tutun.
- Adım 5.1'de plakanın her bir oyuğundan bazal membran matrisini aspire edin.
- Her oyuğa 1 x 103 hücre/50 μL hedef hücre (adım 5.2.4) ekleyin ve iyice karıştırın.
not: Ortamın buharlaşmasından kaynaklanan kenar etkilerini önlemek için, analiz için sadece 96 oyuklu plakanın iç 60 kuyusu kullanılmalıdır.
- 4 x 103 U/mL IL-2 ve 10 μM florojenik kaspaz-3 substratı dahil olmak üzere 25 μL E-DMEM ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
- 4 x 103 hücre/25 μL CD8+ T hücresi (adım 5.3.4) uygun kuyucuklara ekleyin ve iyice karıştırın.
not: Bir kuyuda çok fazla hücre bulunması analizi daha zor hale getirir. Bu modelde, 4:1 efektör: hedef oranı (toplam hücre sayısı 5 x 103 hücre/kuyucuk) optimaldi, ancak 8:1 oranı optimal değildi. Veri analizine yardımcı olmak için aşağıdaki dört kontrolü içeren kuyucuklar gereklidir: kaspaz-3 substratı olan ve olmayan ortamda ko-kültür kuyuları için kullanılan yoğunlukta hedef hücreler (1 x 103 hücre/kuyu), kaspaz-3 substratı olan ve olmayan ortamda efektör hücreler (1 x 103 hücre/kuyu).
- Deneysel kuyulardan ortamın buharlaşmasını azaltmak için tüm boş kuyulara (özellikle plakanın çevresindeki kuyulara) 200 μL PBS veya steril su ekleyin.
- Plakayı 37 °C, %95 nem ve %5 CO2.
'de tutulan hızlandırılmış bir floresan mikroskobuna yerleştirin
not: Tüm hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı çapraz düzende sallayın ve ardından inkübatöre aktarmadan önce plakanın düz bir yüzeyde 10-20 dakika oda sıcaklığında kalmasına izin verin.
6. Hücrelerin görüntülenmesi
NOT: Ayrıntılı görüntü elde etme ayarları, kullanılan mikroskop ve floroforlara göre değişecektir; en iyi sonuçlar için aşağıdaki genel elde etme parametreleri kullanılmalıdır.
- Mikroskop üzerinde uygun bir otofokus rutini kullanarak, 96 oyuklu plakanın her deneysel kuyucuğundaki toplam yüzey alanının en az% 25'ini kaplayan görüntüler elde edin.
- Mikroskobu, faz kontrastlı görüntülerin yanı sıra nükleer kısıtlı kırmızı floresan proteini (mKate2) için uygun bir floresan kanalı ve yeşil florojenik aktive kaspaz-3 substratı için uygun bir floresan kanalı (488 nm'de uyarma ile) elde edecek şekilde ayarlayın (Şekil 2).
- Faz kontrastlı deneysel kuyularda ve 2 floresan kanalında en az 72 saat boyunca her 1 ila 3 saatte bir görüntü yakalayın.
