Makrofajlarda Multipl Kaspazların Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Han, J. ve diğerleri, Doğuştan Gelen Bağışıklık Hücresi Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi.J. Vis. Uzm.(2023)

Bu video, influenza virüsü ile stimülasyon yoluyla kemik iliği kaynaklı makrofajlarda çoklu kaspaz aktivasyonlarının değerlendirmesini göstermektedir. Makrofaj lizizi, lizatın ısıyla inaktivasyonu ve santrifüjlemeyi takiben, sonraki immünolojik analizler için hücre içi kaspazlar toplanır.

Protokol

1. Çözümlerin hazırlanması

1. L929 koşullu ortam hazırlayın.
   1. Plaka 1 × 10⁶ L929 hücreleri (Malzeme Tablosuna bakınız) 50 mL L929 kültür ortamı içeren 182^cm2'lik bir doku kültürü şişesinde (ortamın hazırlanması için Tablo 1'e bakınız).
   2. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de% 5 karbondioksit, CO₂ ile büyütün.
   3. 7 gün sonra, süpernatanı toplayın ve 0.45 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin. 50 mL alikot hazırlayın (donmuş alikotları -80 ° C'de 1 yıla kadar saklayın).
2. 500 mL kemik iliği kaynaklı makrofaj (BMDM) kültür ortamı hazırlayın (Tablo 1).
3. 500 mL BMDM stimülasyon ortamı hazırlayın (Tablo 1).
4. Enfeksiyon için 500 mL besiyeri hazırlayın (Tablo 1).
5. 100 mL 1 M Tris tamponu hazırlayın (Tablo 1).
6. 4x sodyum dodesil sülfat (SDS) tamponu hazırlayın (Tablo 1).
7. 1 mL 1 M 1,4-ditiotreitol hazırlayın (DTT, Tablo 1).
8. 40 mL kaspaz lizis tamponu hazırlayın (Tablo 1).
9. 100 mL 1.5 M Tris tamponu hazırlayın (Tablo 1).
10. 100 mL% 10 (ağırlıkça / hacim) SDS çözeltisi hazırlayın (Tablo 1).
11. 50 mL'lik bir 2x radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu hazırlayın (Tablo 1).
12. 5 mg / mL lipopolisakkarit, LPS çözeltisi hazırlayın (Tablo 1).
13. 0.5 M adenosin trifosfat, ATP çözeltisi hazırlayın (Tablo 1).
14. Batı lekeleme çözeltilerini hazırlayın.
    1. 1 L 5x çalışan tampon stoğu hazırlayın (Tablo 1).
    2. 1 L 10x transfer tamponu stoğu hazırlayın (Tablo 1).
    3. Tween 20 ile 1 L Tris tamponlu salin hazırlayın (TBST, Tablo 1).
    4. 100 mL %5 (ağırlıkça/hacimce) yağsız süt bloke etme solüsyonu hazırlayın (Tablo 1).
15. Birincil antikor çözeltilerini hazırlayın.
    1. 10 mL kaspaz-1 primer antikoru hazırlayın (Tablo 1).
    2. 10 mL kaspaz-11 primer antikoru hazırlayın (Tablo 1).
    3. 10 mL kaspaz-3 primer antikoru hazırlayın (Tablo 1).
    4. 10 mL kaspaz-7 primer antikoru hazırlayın (Tablo 1).
    5. 10 mL kaspaz-8 primer antikoru hazırlayın (Tablo 1).
    6. 10 mL kaspaz-9 primer antikoru hazırlayın (Tablo 1).
    7. 10 mL HRP konjuge β-aktin primer antikoru hazırlayın (Tablo 1).
16. İkincil antikor çözeltilerini hazırlayın.
    1. 10 mL anti-tavşan ikincil antikoru hazırlayın (Tablo 1).
    2. 10 mL anti-fare ikincil antikoru hazırlayın (Tablo 1).
    3. 10 mL anti-sıçan ikincil antikoru hazırlayın (Tablo 1).

2. Kemik iliği kaynaklı makrofajların izole edilmesi

>NOT: Bu protokol için, bozulmamış programlanmış hücre ölümü (PCD) yolaklarına sahip 6-10 haftalık vahşi tip fareler veya PCD düzenleyicileri, efektörleri veya ilgilenilen molekülleri silinmiş veya değiştirilmiş mutant fareler kullanılabilir.

1. Bir fareyi,_2-3 dakika boyunca dakikada kafes hacminin -30'unu değiştiren bir akış hızına sahip bir CO 2 odasında ötenazi yapın. Ardından, rahim ağzı çıkığı gibi ikincil bir ötenazi yöntemi uygulayın. Uygun olan yerlerde tüm ek tesis, kurum ve hükümete özgü yönergelere ve düzenlemelere uyun.
2. Arka bacak kemiklerini almak için fareyi inceleyin.
   1. Fareyi, karın açıkta kalacak şekilde sırtına sabitleyin. Arka bacakları ve karnı sterilize etmek için p (hacim/hacim) etanol püskürtün.
      Dikkat: Etanol yanıcıdır. Açık alevlerden uzak tutun.
   2. Karnın orta hattında bir kesi yapmak için makas kullanın; femurları görünür kılmak için bacaklara doğru kesmeye devam edin.
   3. Sağ arka bacağınızı alın ve cildi vücuttan orta hatta doğru çekin. Adduktor kaslarını orta hatta doğru keserek bacağı vücuttan ayırın; Daha sonra bacağı kalça eklemi ile omurga arasında kesin. Daha sonra, pençeyi ayak bileğinin distalinden kesin ve cildi soyarak ve baldır dokusunu sıyırmak için hafifçe açılmış makas kullanarak kemikten fazla dokuyu çıkarın.
   4. Bacağınızı p (hacim/hacim) etanolle ıslatılmış bir havluya yerleştirin ve kaval kemiği ve uyluk kemiğini inceleyin.
      1. Tibia ve femuru her biri ayrı bir forseps seti ile sıkıştırın. Kaval kemiğini diz ekleminin doğal yönüne doğru hafifçe bastırın; Bu, kaval kemiğinin dizde kırılmasına neden olur.
      2. Kalan asılı dokuyu çıkarmak için gerekirse forseps ve diseksiyon makasını kullanın. Kaval kemiğini etanolle ıslatılmış havlunun üzerine koyarak daha sonra kullanmak üzere saklayın.
      3. Femuru da aynı şekilde, dizinizi kopararak toplayın.
   5. Sol bacağı vücuttan çıkarmak ve tibia ve uyluk kemiğini incelemek için yukarıdaki 3. ve 4. adımları tekrarlayın.
   6. Kemiklere p (hacim/hacim) etanol püskürtün.
   7. Kemikleri temiz% 70 (hacim / hacim) etanolle ıslatılmış bir havluya koyarak, havludaki etli kısmı sıkarak ve fazla dokuyu çıkarmak için havluyu kemiğe sürterek temizleyin.
3. Hem uyluk kemiği hem de her iki tibia temizlendikten sonra, dört kemiğe de p (hacim/hacim) etanol püskürtün. Kemikleri steril bir Petri kabında toplayın ve 10 mL BMDM kültür ortamı ile kabı hafifçe çalkalayarak durulayın.
4. 10 mL'lik bir şırıngayı 10 mL taze BMDM kültür ortamı ile doldurun ve 25 G'lik bir iğne takın.
5. Forseps kullanarak tibiayı kaldırın; Ardından, ayak bileği eklemini ~ 45 ° açıyla kesin.
6. Kemik iliğini tibiadan temizleyin.
   1. Tibiayı 50 mL'lik bir tüpün üzerinde, tibianın dar ucu aşağı bakacak şekilde tutun. Ortamı doldurulmuş şırıngadan tibia üzerine dağıtın.
   2. İğneyi (ilk başta nazikçe) iliğin üst ucuna yerleştirin ve ortamı dağıtın.
   3. İğneyi çıkarın ve tekrar takın. Ortamı dağıtmak için kısa, yüksek basınçlı itmeler kullanın ve iğneyi iliğe doğru hareket ettirin.
   4. Ortam kemiğin altından dışarı akmaya başladığında, hücreleri dışarı atmaya devam etmek için kısa, yüksek basınçlı itmeler kullanın. Bu işlem sırasında kemiğin rengini izleyin ve kemik beyaz olduğunda atın.
   5. Bunu her iki tibia için de yapın.
7. Femurlar için yukarıdaki 5. ve 6. adımları tekrarlayın, tibia ayak bileği ekleminde kesilirken kalça ekleminde kesin. Kemik iliği yıkanırken BMDM kültür ortamını toplamak için aynı 50 mL'lik tüpü kullanın.
8. Dört kemiğin tümü yıkandıktan sonra, iliği ve ortamı 50 mL'lik tüpten 10 mL'lik bir şırınga üzerindeki 18 G'lik bir iğneden 3 kat yukarı ve aşağı aspire edin ve iliği dağıtmak için her seferinde tüpün kenarlarını durulayın.
9. 50 mL'lik tüpteki son hacmi BMDM kültür ortamı ile 30 mL'ye ayarlayın ve hücrelerin tamamen askıya alındığından emin olun.
10. BMDM kültür ortamını 50 mL'lik tüpten filtrelemek için 70 μm'lik bir hücre süzgeci kullanın.
11. Kemik iliği progenitör hücrelerini içeren elde edilen hücre süspansiyonunu, her birine 10 mL (veya ~ 20 × 10⁶ hücre) ekleyerek üç adet 150 mm'lik doku kültürü kabına yerleştirin. Ardından, her yemeğe 10 mL daha BMDM kültür ortamı ekleyin. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.

3. BMDM'lerin ayırt edilmesi ve deneyler için kaplama

yapılması

1. Kaplanmış kemik iliği progenitör hücrelerini 37 ° C'de 3 gün boyunca inkübe edin. Daha sonra, her bir kabı çıkarın ve 5-8 mL daha BMDM kültür ortamı ekleyin (Tablo 1). 37 °C'de inkübatöre geri dönün.
2. İlk kaplamadan sonraki 5. günde, her bir kabı çıkarın ve 5 mL daha BMDM kültür ortamı ekleyin. 37 °C'de inkübatöre geri dönün.
3. 6. günde, her bir tabağı çıkarın ve ortamı atın. Ardından, bir kez yıkamak için 10 mL soğuk (4 ° C'de saklanmış) fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ekleyin. 10 mL soğuk PBS yıkamayı atın. Ardından, her yemeğe 10 mL taze, soğuk PBS ekleyin ve her yemeği 5 dakika buz üzerinde inkübe edin.
4. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri üç tabaktan da 50 mL'lik bir tüpe nazikçe kazıyın. Hücreleri 270 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca yavaşça döndürün; Ardından, süpernatanı atın.
5. 20 mL BMDM kültür ortamı ekleyin, peleti yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücreleri sayın.
   not: Her farenin yaklaşık 60 × 10 6-100 × 10 ⁶ hücre vermesi beklenmektedir.
6. İstenen in vitro hücre ölümü / inflamasyon stimülasyon testi için 12 oyuklu plaka düzenini planlayın. Kuyucuk başına 1 × 10⁶ hücre plakalamayı planlayın. Planlanan her stimülasyon için, en az üç biyolojik kopya ekleyin ve kaspaz lizis tamponunda hasat edilecek bir kuyu seti ve RIPA tamponunda hasat edilecek ikinci bir kuyu seti yerleştirin.
7. Plaka 1 × 12 oyuklu plakalarda kuyu başına 1 mL BMDM kültür ortamında^{10 6} hücre. Hücre ölümü / iltihaplanma değerlendirmesine geçmeden önce 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca kültür. Gece boyunca inkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri yıkamak için her bir oyuğa 1 mL ılık (37 ° C) PBS ekleyin.
8. PBS yıkamasını çıkarın ve antibiyotikli 500 μL BMDM stimülasyon ortamı (bakteriyel olmayan stimülasyonlar yapılıyorsa) veya antibiyotiksiz BMDM stimülasyon ortamı (bakteriyel stimülasyonlar yapılıyorsa) ekleyin (Tablo 1). İn vitro stimülasyon / enfeksiyon için 4. adıma geçmeden önce 2 saat inkübe edin.

4. Hücreleri uyarmak veya enfekte etmek

DİKKAT: Bu protokolde yer alan ajanlar potansiyel olarak patojeniktir ve ilgili kurumsal ve resmi makamların onayı ile bir biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) tesisinde uygun önlemlerle birlikte ele alınmalıdır.

1. İlgilenilen tetikleyici ile hücre ölümünü aktive etmek için BMDM'leri uyarın.
   not: Bu protokolün amaçları doğrultusunda, influenza A virüsü (IAV), herpes simpleks virüsü 1 (HSV1), Francisella novicida ve LPS + ATP örnekleme için kullanılır, ancak diğer tetikleyiciler de kullanılabilir.
   1. Örnek stimülasyon 1: IAV ile enfekte (A/Porto Riko/8/34, H1N1 [PR8]) (Hoffmann ve ark.'ya göre yapılandırılmıştır; enfeksiyon çokluğu [MOI] tayini için viral titre, MDCK hücrelerinde bir plak tahlili ile hesaplanır):
      1. Denklem (1) ve denklem (2) kullanarak 20 plak oluşturan birimin (PFU) çok sayıda enfeksiyonunda (MOI) enfeksiyon için gereken virüs hacmini hesaplayın:
         
         
         
   2. Ortamı BMDM'lerden çıkarın ve hücreleri bir kez 500 μL PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuğa ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HI) -FBS olmadan yüksek glikozlu DMEM'de 450 μL IAV (20 MOI) ekleyin. Emilimi sağlamak için plakaları nemlendirilmiş bir inkübatörde 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   3. Plakaları çıkarın ve 50 μL HI-FBS ekleyin. Plakaları 37 °C'de inkübatöre geri koyun. Toplam 12 saat inkübe edin.

5. Kaspaz western blotları için kullanılacak kombine süpernatan ve protein lizatının toplanması

1. 4 saat, 12 saat veya 16 saat inkübasyondan sonra (belirli zamanlama kullanılan tetiğe bağlıdır), plakayı inkübatörden çıkarın.
2. Süpernatanın 150 μL'sini çıkarın; bunu diğer süpernatan analizleri için atın veya saklayın (örneğin, enzime bağlı immünosorbent testi [ELISA]). Kalan süpernatanı çıkarmayın.
3. Kuyucuk başına 50 μL kaspaz lizis tamponu + 100 μL 4x SDS tamponunu birleştirerek protein toplama çözeltisini oluşturun (Tablo 1). Ardından, her bir oyuğa 150 μL karışım ekleyin.
4. Her kuyucuk için, parçalanmış hücreleri ve süpernatanı toplamak için karışımı yukarı ve aşağı pipetleyin. Pipetleme yaparken, hücreleri bozmak için pipet ucuyla kuyunun dibini de kazıyın. Kazıma ve pipetlemeden sonra, protein lizatını etiketli 1,5 mL'lik tüplere toplayın.
5. Tüm tüpleri 12 dakika boyunca 100 °C'ye ısıtmak için bir ısı bloğu kullanın.
6. Çözünmeyen bileşenleri oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 14.500 × g'da santrifüjleyerek peletleyin.
   NOT: Bu bir duraklama noktasıdır - kombine süpernatan ve protein lizatlarından elde edilen protein hemen kullanılabilir veya -20 °C'de 2 aya kadar veya -80 °C'de 6 aya kadar kullanıma hazır olana kadar saklanabilir.

.

kategori	Reaktif	hazırlık	Açıklamalar	Güvenlik Önlemleri
Medya	L929 kültür ortamı	1) Isı FBS'yi etkisiz hale getirir (açıklamalara bakın). 2) 43.5 mL Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (IMDM), 5 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HI-FBS), 0.5 mL sodyum piruvat, 0.5 mL esansiyel olmayan amino asitler ve 0.5 mL penisilin ve streptomisin	FBS'yi 56 °C'de 30 dakika inkübe ederek ısıyla etkisiz hale getirin.
	Kemik iliği kaynaklı makrofaj (BMDM) kültür ortamı	290 mL IMDM, 150 mL L929 şartlandırılmış ortam ve 5 mL esansiyel olmayan amino asit, 50 mL HI-FBS ve 5 mL penisilin ve streptomisin'i birleştirin.	Kullanmadan önce ortamı su veya boncuk banyosunda 37 °C'ye ısıtın. Besiyeri 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
	Antibiyotikli BMDM stimülasyon ortamı	445 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), 50 mL HI-FBS ve 5 mL penisilin ve streptomisin'i birleştirin.	Kullanmadan önce ortamı su veya boncuk banyosunda 37 °C'ye ısıtın. Besiyeri 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
	Antibiyotiksiz BMDM stimülasyon ortamı	450 mL DMEM ve 50 mL HI-FBS'yi birleştirin.	Kullanmadan önce ortamı su veya boncuk banyosunda 37 °C'ye ısıtın. Besiyeri 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
	Enfeksiyon ortamı (HI-FBS yok)	495 mL yüksek glikozlu DMEM'i 5 mL penisilin ve streptomisin ile birleştirin.	Kullanmadan önce ortamı su veya boncuk banyosunda 37 °C'ye ısıtın. Besiyeri 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
Sodyum dodesil sülfat (SDS) tamponu	1 M Tris tampon (4x SDS arabelleği için)	1) 12.11 g Tris'i 80 mL deiyonize suda çözün. 2) Karıştırırken HCl damlaları ekleyerek pH'ı 6.8'e ayarlayın. 3) Son hacmi 100 mL'ye ayarlamak için deiyonize su ekleyin.	Tampon 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.	HCl yakıcıdır. Daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın; Buna bir laboratuvar önlüğü ve eldivenler dahildir. HCl bir davlumbaz içinde ele alınmalıdır.
	4x SDS arabelleği	1) 60 mL 1 M Tris (pH 6.8) çözeltisi, 24 mg SDS, 100 mg bromofenol mavisi, 120 mL gliserol, 8.4 mL β-merkaptoetanol (BME) ve 90 mL deiyonize suyu birleştirin. 2) Tuzların çözeltiye girmesine izin vermek için bir ısıtma karıştırma plakası üzerinde karıştırın. 3) Son hacmi 300 mL'ye ayarlamak için deiyonize su ekleyin.	Tampon alınabilir ve −20 ° C'de 1 yıla kadar saklanabilir.	SDS yakıcıdır ve BME kanserojendir. Daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın; Buna bir laboratuvar önlüğü ve eldivenler dahildir. SDS ve BME bir davlumbazda ele alınmalıdır.
Kaspaz lizis tamponu	1 M 1,4-ditiyotreitol (DTT)	0.154 g DTT tozunu 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün. DTT'nin çözüme girmesine izin verin.	Tampon 200 μL'lik alikotlara ayrılabilir ve -20 ° C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
	Kaspaz lizis tamponu	35 mL deiyonize su, 4 mL NP-40, 750 μL 1 M DTT, 1 proteaz inhibitör tableti ve 1 fosfataz inhibitör tableti birleştirin.	Tampon 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
Radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu	1,5 M Tris tampon (RIPA arabelleği için)	1) 18.2 g Tris'i 80 mL deiyonize suda çözün. 2) Karıştırırken damla NaOH ekleyerek pH'ı 8.8'e ayarlayın. 3) Son hacmi 100 mL'ye ayarlamak için deiyonize su ekleyin.	Tampon 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.	NaOH aşındırıcıdır ve yanıklara neden olabilir. Daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın; Buna bir laboratuvar önlüğü ve eldivenler dahildir.
	(ağırlık/hacim) SDS çözümü (RIPA arabelleği için)	1) 80 mL deiyonize suya 10 g SDS ekleyin. 2) Eriyene kadar karıştırın. 3) Son hacmi 100 mL'ye ayarlamak için deiyonize su ekleyin.	Çözelti oda sıcaklığında 6 aya kadar saklanabilir. Çözelti çökelirse, yeniden çözünmesi için hafifçe ısıtın.	SDS yakıcıdır. Daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın; Buna bir laboratuvar önlüğü ve eldivenler dahildir. SDS bir davlumbaz içinde ele alınmalıdır.
	RIPA arabelleği (2x stok)	1) 0.5 g sodyum deoksikolat, 1 mL NP-40, 0.876 g NaCl, 3.3 mL 1.5 M Tris (pH 8.8) ve 1 mL (ağırlıkça/hacim) SDS'yi 46 mL deiyonize suda birleştirin. 2) Eriyene kadar karıştırın. 3) Son hacmi 50 mL'ye ayarlamak için deiyonize su ekleyin.	2x RIPA stoğu 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.	SDS yakıcıdır. Daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın; Buna bir laboratuvar önlüğü ve eldivenler dahildir. SDS bir davlumbaz içinde ele alınmalıdır.
Steril tetikleyiciler	Lps	E. coli 0111: B4'ten liyofilize LPS'yi endotoksin içermeyen suda 5 mg / mL'lik bir konsantrasyona çözün.	Çözelti -20 °C'de 2 yıla kadar saklanabilir.
	0,5 M ATP	1 g liyofilize ATP'yi 3.63 mL endotoksin içermeyen suda çözün.	Çözelti satın alınabilir ve -20 °C'de 2 yıla kadar saklanabilir.
Batı lekeleme çözümleri	Çalışan buffer (5x stok)	1) 15 g Tris bazı, 72 g glisin ve 5 g SDS'yi 900 mL deiyonize suda birleştirin. 2) Partikül kalmayana kadar karıştırın. 3) Son hacmi 1 L'ye ayarlamak için deiyonize su ekleyin.	Tampon oda sıcaklığında 6 aya kadar saklanabilir.	SDS yakıcıdır. Daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın; Buna bir laboratuvar önlüğü ve eldivenler dahildir. SDS bir davlumbaz içinde ele alınmalıdır.
	Aktarım tamponu (10x hisse senedi)	1) 30.3 g Tris bazı ve 72 g glisini 900 mL deiyonize suda birleştirin. 2) Partikül kalmayana kadar karıştırın. 3) Son hacmi 1 L'ye ayarlamak için deiyonize su ekleyin.	Tampon oda sıcaklığında 3 aya kadar saklanabilir.
	Tween 20 (TBST) ile tris tamponlu salin	1) 2.42 g Tris bazı ve 8.76 g NaCl'yi 850 mL deiyonize suda çözün. 2) Karıştırırken HCl damlaları ekleyerek pH'ı 7.4'e ayarlayın. 3) Son hacmi 1 L. olarak ayarlamak için deiyonize su ekleyin 4) 0,5 mL Tween 20 ekleyin (nihai konsantrasyon %0,05 (hacim/hacim)).	Çözelti oda sıcaklığında 1 ay saklanabilir.	HCl yakıcıdır. Daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın; Buna bir laboratuvar önlüğü ve eldivenler dahildir. HCl bir davlumbaz içinde ele alınmalıdır.
	%5 (ağırlıkça/hacim) yağsız süt engelleme çözeltisi	5 g yağsız kurutulmuş süt tozunu 100 mL TBST'de çözün.	Çözelti 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
Birincil antikorlar	Kaspaz-1 primer antikor	Anti-kaspaz-1 antikorunu 1: 1.000 (hacim / hacim) 10 mL% 5 (ağırlıkça / hacim) yağsız süt bloke etme çözeltisine 10 μL antikor ekleyerek seyreltin.	En iyi sonuçlar için, her deney için taze yapın. Bununla birlikte, bu çözelti etkinlik kaybı olmadan en az 3 kez kullanılabilir. Yeniden kullanılıyorsa −20 °C'de saklayın.
	Kaspaz-11 primer antikor	Anti-kaspaz-11 antikorunu 1: 1.000 (hacim / hacim) 10 μL antikoru 10 mL% 5 (ağırlıkça / hacim) yağsız süt bloke etme çözeltisine ekleyerek seyreltin.	En iyi sonuçlar için, her deney için taze yapın. Bununla birlikte, bu çözelti etkinlik kaybı olmadan en az 3 kez kullanılabilir. Yeniden kullanılıyorsa −20 °C'de saklayın.
	Kaspaz-3 primer antikoru	Anti-kaspaz-3 antikorunu ve anti-bölünmüş kaspaz-3 antikorunu 1: 1.000 (hacim / hacim), aynı 10 mL% 5 (ağırlıkça / hacim) yağsız süt bloke etme çözeltisine her bir antikorun 10 μL ekleyerek seyreltin.	En iyi sonuçlar için, her deney için taze yapın. Bununla birlikte, bu çözelti etkinlik kaybı olmadan en az 3 kez kullanılabilir. Yeniden kullanılıyorsa −20 °C'de saklayın.
	Kaspaz-7 primer antikoru	Anti-kaspaz-7 antikorunu ve anti-bölünmüş kaspaz-7 antikorunu 1: 1.000 (hacim / hacim), aynı 10 mL% 5 (ağırlıkça / hacim) yağsız süt bloke etme çözeltisine her antikorun 10 μL ekleyerek seyreltin.	En iyi sonuçlar için, her deney için taze yapın. Bununla birlikte, bu çözelti etkinlik kaybı olmadan en az 3 kez kullanılabilir. Yeniden kullanılıyorsa −20 °C'de saklayın.
	Kaspaz-8 primer antikoru	Anti-kaspaz-8 antikorunu ve anti-bölünmüş kaspaz-8 antikorunu 1: 1.000 (hacim / hacim), aynı 10 mL% 5 (ağırlıkça / hacim) yağsız süt bloke etme çözeltisine her antikorun 10 μL ekleyerek seyreltin.	En iyi sonuçlar için, her deney için taze yapın. Bununla birlikte, bu çözelti etkinlik kaybı olmadan en az 3 kez kullanılabilir. Yeniden kullanılıyorsa −20 °C'de saklayın.
	Kaspaz-9 primer antikor	Anti-kaspaz-9 antikorunu 1: 1.000 (hacim / hacim) 10 μL antikoru 10 mL% 5 (ağırlıkça / hacim) yağsız süt bloke etme çözeltisine ekleyerek seyreltin.	En iyi sonuçlar için, her deney için taze yapın. Bununla birlikte, bu çözelti etkinlik kaybı olmadan en az 3 kez kullanılabilir. Yeniden kullanılıyorsa −20 °C'de saklayın.
	HRP ile konjuge β-aktin primer antikoru	Anti-β-aktin antikorunu 1: 5.000 (hacim / hacim), 10 mL% 5 (ağırlıkça / hacim) yağsız süt bloke etme çözeltisine 2 μL antikor ekleyerek seyreltin.	Bu antikor her deney için taze olarak hazırlanmalıdır.
İkincil antikorlar	Anti-tavşan antikoru	Yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge ikincil antikoru 1:5.000 (hacim: hacim) 10 mL %5 (ağırlıkça / hacim) yağsız süt engelleme çözeltisine 2 μL antikor ekleyerek seyreltin.	Antikor seyreltmesi her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır.
	Anti-fare antikoru	HRP ile konjuge ikincil antikoru 1:5.000 (hacim: hacim) 10 mL'lik %5 (ağırlıkça/hacim) yağsız süt blokaj çözeltisine 2 μL antikor ekleyerek seyreltin.	Antikor seyreltmesi her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır.
	Anti-sıçan antikoru	HRP ile konjuge ikincil antikoru 1:5.000 (hacim: hacim) 10 mL'lik %5 (ağırlıkça/hacim) yağsız süt blokaj çözeltisine 2 μL antikor ekleyerek seyreltin.	Antikor seyreltmesi her seferinde taze olarak hazırlanmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,45 μm filtre	Kırlangıç	SCHVU05RE
10 mL şırınga	BD Biyolojik Bilimler	309604
12 oyuklu plaka	Corning	07-200-82
18 G iğne	BD Biyolojik Bilimler	305195
25 G iğne	BD Biyolojik Bilimler	305122
50 mL tüp	Balıkçı Bilimsel	50-809-218
70 μm hücre süzgeci	Corning	431751
150 mm doku kültürü kapları	Corning	430597
182 cm2 doku kültürü şişesi	Genesee Bilimsel	25-211
Atp	İnvivoGen	tlrl-atpl
BBL Triptikaz Soya Suyu	BD Biyolojik Bilimler	211768
Boncuk banyosu	Chemglass Yaşam Bilimleri	CLS-4598-009
Biyofotometre D30	Eppendorf Belediyesi	6133000010
Hücre sıyırıcılar	CellTreat Bilimsel Ürünler	229315
CO2 odası	Veteriner Ekipmanları	901703
Küvetler	Balıkçı Bilimsel	14-955-129
Diseksiyon makası	Thermo Fisher Bilimsel	221'LI YILLAR
DMEM (Ömer Çiçeğ	Thermo Fisher Bilimsel	11995-073
etanol	Eczacılık	111000200
Fetal sığır serumu	Biyobatı	S1620 Serisi
Filtre kağıdı	Biyo-Rad	1703965
Forseps	Balıkçı Bilimsel	22-327379
Francisella novicida (U112 suşu)	BEI Kaynakları	NR-13
Gentamisin	Gibco (Gibco)	15750060
Isı bloğu	Balıkçı Bilimsel	23-043-160
Herpes simpleks virüsü 1 (HF suşu)	ATCC (Uzay Servisi)	VR-260
Yüksek glukoz DMEM	Sigma	D6171
Nemlendirilmiş inkübatör	Thermo Fisher Bilimsel	51026282
IMDM	Thermo Fisher Bilimsel	12440-053
İnfluenza A virüsü (A/Porto Riko/8/34, H1N1 [PR8])	Hoffmann ve ark. tarafından inşa edilmiştir.
L929 hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-1	L929 koşullu ortam oluşturmak için hücre hattı
L-sistein	Thermo Fisher Bilimsel	BP376-100
MDCK hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-34	IAV viral titresini belirlemek için hücre hattı
Mikrosantrifüj	Thermo Fisher Bilimsel	75002401
Esansiyel olmayan amino asitler	Gibco (Gibco)	11140050
NP-40 çözümü	Sigma	492016
Pbs	Thermo Fisher Bilimsel	10010023
Penisilin ve streptomisin	Sigma	P4333 Serisi
Petri kabı	Balıkçı Bilimsel	07-202-011
FosSTOP (FosSTOP)	Roche	PHOSS-RO
Güç kaynağı	Biyo-Rad	164-5052
Proteaz inhibitörü tableti	Sigma	S8820 Serisi
Sodyum hidroksit	Sigma	72068
Sodyum piruvat	Gibco (Gibco)	11360-070
Kare Petri kabı	Balıkçı Bilimsel	FB0875711A
Masa üstü santrifüj	Thermo Fisher Bilimsel	75004524
E. coli 0111:B4'ten ultra saf lipopolisakkarit (LPS)	İnvivoGen	tlrl-3pelps
Vero hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-81	HSV1 viral titresini belirlemek için hücre hattı

Serisi Serisi Serisi Serisi Sertifikası Serisi Serisi Serisi (İngilizce) Serisi