İnsan Gözyaşı Örneklerinde Sitokinleri Analiz Etmek için Multipleks Boncuk Bazlı Bir Test

Özet

Kaynak: Balne, P. K., et al. Gözyaşı Sitokin Profillerinin Analizi için Boncuk Bazlı Multipleks Testi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, insan gözyaşlarındaki sitokinleri analiz etmek için boncuk tabanlı bir multipleks testi göstermektedir. Yöntem, tek bir numuneden birden fazla sitokinlerin aynı anda analizine izin vererek, çeşitli patofizyolojik durumlarda immün yanıtları incelemek için gelişmiş duyarlılık sağlar.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Gözyaşı Sitokin Analizi

1. Gözyaşı koleksiyonu:
   1. Denekten muayene koltuğuna rahatça oturmasını ve başını koltuk başlığına dayamasını isteyin.
   2. Denekten yukarı bakmasını isteyin, Schirmer şeritlerini (Whatman filtre kağıdı no. 41'den yapılmıştır) dikkatlice açın, şeridin yuvarlak ucunu gözün alt forniksine yerleştirin ve deneğe gözlerini 5 dakika boyunca kapatmasını söyleyin. Gözyaşını toplarken oküler yüzey temasını en aza indirmeye büyük özen gösterin.
   3. Denekten şeridi çıkarmak için gözlerini açmasını ve steril 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirmesini isteyin. Tüpü hemen laboratuvara aktarın veya sitokin profili oluşturma testi yapana kadar -80 ^°C'de saklayın.
2. Gözyaşı akış şeridinden gözyaşı örneğinin elüsyonu:
   1. Gözyaşı akış şeridini 0,5 cm uzunluğunda kesin (test edilecek gözyaşı miktarını standartlaştırmak için) ve steril 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
   2. 30 μL tahlil tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, ardından tüpü 1 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı başka bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve şeridi atın. Tüpü içeren numuneyi buz üzerine yerleştirin ve sitokin profili oluşturmak için hemen ayrıştırılmış gözyaşı numunesini kullanın.
3. Reaktiflerin hazırlanması:
   NOT: Her numunede boncuk bazlı multipleks testi ile test edilecek kırk bir analit, interlökin (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferon-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gama ile indüklenebilir protein 10 (IP-10, CXCL10), makrofaj türevi kemokin (MDC), makrofaj inflamatuar protein (MIP)-1α ve MIP-1β, monosit kemotaktik protein (MCP)-1, MCP-3, tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α), TNF-β, büyüme regüle onkogen (GRO), tümör büyüme faktörü alfa (TGF-α), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF)-2, trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF), granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF), eotaksin, fraktalkin, çözünür CD40 ligandı (sCD40L), Fms benzeri tirozin kinaz 3 ligandı (Flt-3L) ve aktivasyon üzerine düzenlenen, normal T hücresi eksprese edilen ve salgılanan protein (RANTES).
   1. Antikor boncuk çözeltisi (50X) şişelerini oda sıcaklığına (20 – 25 ^oC) getirin ve şişeleri 1 dakika boyunca girdaplayın.
   2. Test için gerekli kuyucuk sayısını sayın ve test için gereken toplam antikor boncuk kokteyl çözeltisinin (oyuk başına 25 μL) ve her bir antikor boncuk çözeltisinin (50X) miktarını hesaplayın.
   3. Her bir antikor boncuk çözeltisinin hesaplanan miktarını ekleyerek kokteyl çözeltisini hazırlayın ve kalan boncuk seyreltici miktarını ekleyerek istenen nihai hacme kadar doldurun. Kokteyldeki her bir antikorun nihai konsantrasyonunun 1X olduğundan emin olun. Pipetleme hataları durumunda her zaman en az %20 ekstra hacimde kokteyl çözeltisi hazırlayın.
      not: Örnek olarak, 96 oyuklu bir tahlil için 3000 μL antikor boncuk kokteyli çözeltisi hazırlayın. Her bir antikor boncuk çözeltisinin gerekli miktarı = her bir antikor boncuk çözeltisinin 3000/stok konsantrasyonu; 3000/50 = 60 μL her bir antikor boncuk çözeltisi
      1. 41 antikor boncuk çözeltisinin her birinden (60 X 41 = 2460 μL) 60 μL'yi bir kokteyl şişesine ekleyin ve 3000 μL nihai çalışma çözeltisi (1X) yapmak için antikor boncuk karışımına 540 μL boncuk seyreltici çözeltisi ekleyin.
      2. Kullanmadan önce boncuk kokteyli solüsyonunu uygun şekilde karıştırın. Testten sonra kalan hacmi 2-8 ^°C'de 30 güne kadar saklayın.
   4. QC 1 ve QC 2 stoklarına 250 μL deiyonize su ekleyerek kalite kontrollerini (QC) hazırlayın.
   5. Şişeleri birkaç kez ters çevirerek ve 10 saniye boyunca girdaplayarak düzgün bir şekilde karıştırın. Çözeltiyi uygun şekilde etiketlenmiş polipropilen mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve kalan çözeltiyi 30 güne kadar kullanılabilen -20 ^°C'de saklayın.
   6. 30 mL 10X yıkama tamponu çözeltisine 270 mL deiyonize su ekleyerek yıkama tamponunu hazırlayın ve iyice karıştırın (seyreltmeden önce 10X tamponu oda sıcaklığına getirin ve tüm tuz çökeltilerini karıştırarak çözün). Kullanılmayan yıkama tamponunu (1X) 30 güne kadar kullanılabilen 2-8 ^oC'de saklayın.
   7. Stok şişesine 250 μL deiyonize su ekleyerek insan sitokin standart stoğunu (tüm analitlerin 10.000 pg/mL'si) hazırlayın. Birkaç kez ters çevirerek ve şişeyi 10 saniye boyunca girdaplayarak iyice karıştırın. 10 dakika bekletin ve stok çözeltisini uygun şekilde etiketlenmiş polipropilen mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Tahlilden sonra kalan çözeltiyi 30 güne kadar kullanılabilen -20 ^{° C'de}saklayın.
   8. Çalışan insan sitokin standartlarını, 2000, 400, 80, 16 ve 3.2 pg / mL elde etmek için tahlil tamponu ile 5 kat seri seyreltmelerle (50 μL -> 200 μL) hazırlayın.
   9. Standart hazırlıktan sonra, 60 dakika içinde çalışma standartlarını kullanın ve tahlil tamponunu boş/arka plan (-pg/mL) olarak kullanın.
4. Boncuk bazlı multipleks testi ile sitokin profili:
   1. Tüm reaktifleri oda sıcaklığına getirin ve 96 oyuklu mikrotitre plakasına eklemeden önce 5-10 saniye girdap yapın. Ayrıştırılmış gözyaşı örnekleri testten önce -80 ^{° C'de}saklanırsa, donmuş gözyaşı ekstraktlarını buz üzerinde çözdürün ve 5 dakika boyunca 1000 X g'de santrifüjleyin.
   2. Çalışan insan sitokin standartları [0 (Boş), 3.2, 16, 80, 400, 2.000 ve 10.000 pg/mL], QC1, QC2 ve numuneler için dikey konfigürasyonda bir tahlil çalışma sayfası hazırlayın.
   3. Plakanın her bir kuyucuğuna 200 μL 1X yıkama tamponu ekleyin, bir plaka kapatıcı ile kapatın ve oda sıcaklığında (20-25 ^oC) 10 dakika boyunca bir plaka çalkalayıcı üzerinde tutun.
   4. Kuyucuklarda kalan yıkama tamponu miktarını gidermek için plakayı ters çevirerek ve emici havlulara birkaç kez bantlayarak 1X yıkama tamponunu boşaltın.
   5. Çalışan her insan sitokin standardından 25 μL, QC1, QC2, boş (tahlil tamponu) ve numuneleri uygun kuyucuklara ekleyin.
   6. Her oyuğa 25 μL tahlil tamponu ekleyin.
   7. Her oyuğa 25 μL 1X antikor boncuk kokteyli çözeltisi ekleyin. Antikor boncuk çözeltisi ışığa duyarlı olduğundan, plakayı bir plaka kapatıcı ile kapatın ve test sırasında ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün.
   8. Plakayı gece boyunca 4 ^°C'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
   9. Plakayı, otomatik bir manyetik plaka yıkayıcının plaka rafına yerleştirin. Manyetik boncukları kuyunun dibine yerleştirmek ve kuyu içeriğini aspire etmek için 1 dakika bekletin. Kuyucuk başına 200 μL yıkama tamponu ekleyin, 1 dakika bekletin ve ardından kuyu içeriğini aspire edin. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın (plaka yıkama için kit üreticisinin talimatlarına uyun).
   10. Her bir oyuğa 25 μL tespit antikor çözeltisi ekleyin, plakayı kapatın, alüminyum folyo ile örtün ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
   11. Her oyuğa 25 μL Streptavidin-Phycoerythrin çözeltisi ekleyin, plakayı kapatın, alüminyum folyo ile örtün ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
   12. Plakayı manyetik bir plaka yıkayıcı üzerine yerleştirin. 1 dakika bekletin ve ardından kuyu içeriğini aspire edin. Kuyucuk başına 200 μL yıkama tamponu ekleyin. 1 dakika bekletin ve ardından kuyu içeriğini aspire edin. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
   13. Her oyuğa 150 μL kılıf sıvısı ekleyin ve antikor boncuklarını yeniden süspanse etmek için plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
   14. Boncuk bazlı multipleks tahlil plakası okuyucusunu kullanarak plakayı hemen okuyun ve 5 parametreli bir eğri uydurma algoritması kullanarak sitokin konsantrasyonlarını analiz edin. Gözyaşı sitokin profilinin şematik bir akış diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir.
5. Tahlil plakasının okunması (cihaz kurulumu) ve veri analizi:
   1. Boncuk bazlı multipleks tahlil okuyucuyu açın ve lazeri 30 dakika önceden ısıtın.
   2. Boncuk tabanlı multipleks test yazılımını başlatın. 'Otomatik Bakım' sekmesi altında, 'Kalibrasyon doğrulama' seçeneğini seçin. Kalibrasyon ve doğrulama boncuklarının her bir reaktif şişesini 30 saniye boyunca vorteksleyin. Her reaktiften 5 damla belirtilen kuyucuklara yerleştirin. Belirlenen rezervuarları deiyonize su ve% 70 etanol ile doldurun.

Sonuçlar

Şekil 1: Gözyaşı sitokin profilinin şematik akış diyagramı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Milliplex MAP insan sitokin / kemokin manyetik boncuk paneli -1 kiti	Merck, Amerika Birleşik Devletleri	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex cihazı	Luminex Corp, Austin, Teksas, Amerika Birleşik Devletleri
xPonent yazılımı	Luminex Corp, Austin, Teksas, Amerika Birleşik Devletleri
RBXGenerator yazılımı	BIO-RAD, Fransa
Bio-Plex Yöneticisi 6.1	BIO-RAD, Fransa
Plaka çalkalayıcı	Corning, Amerika Birleşik Devletleri
TECAN Mikroplaka Yıkama Makinesi	Tecan, İsviçre	Hidro Hız
Pipetler	Mettler Toledo, Kaliforniya, Amerika Birleşik Devletleri
1.5 ml mikrosantrifüj tüpü	Axygen, Amerika Birleşik Devletleri	MCT-150-C
Schirmer yırtılma akışı test şeridi	Göz Bakımı ve Tedavisi, ABD	101657
Flexmap 3D Kalibrasyon Kiti	Luminex Corp, Austin, Teksas, Amerika Birleşik Devletleri	40-028
Flexmap 3D Doğrulama Kiti	Luminex Corp, Austin, Teksas, Amerika Birleşik Devletleri	40-029
Oküler muayene koltuğu