SARS-CoV-2'yi Görselleştirmek için İmmüno-RNA Floresan In Situ Hibridizasyonun Kullanılması

>1. SARS-CoV-2 RNA-FISH, lameller üzerinde kültürlenen Vero hücrelerinde

>GÜN 1

1. Hücrelerin sabitlenmesi ve geçirgenleştirilmesi
   1. Enfekte olmuş hücreleri RT'de 1 saat boyunca% 3.7 w / v PFA çözeltisi ile sabitleyin.
   2. % 3.7 PFA çözeltisini aspire edin ve hücreleri 1x PBS kullanarak iki kez yıkayın.
   3. Hücreleri PBST çözeltisi ile RT'de 10 dakika boyunca çalkalama ile geçirgenleştirin.
   4. PBST'yi aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
2. Algılama
   1. 1x PBS solüsyonunu aspire edin ve hücreleri RT'de 2x SSC ile iki kez yıkayın.
   2. 2x SSC çözeltisini aspire edin ve en az 300 μL prob hibridizasyon tamponu ekleyerek numuneleri önceden hibridize edin. Hücreleri içeren kuyucukları kapatın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   3. Prob hibridizasyon tamponuna 1.2 pmol prob karışımı ekleyerek prob çözeltisini hazırlayın.
      1. 300 μL çalışma stoğu hazırlamak için 1 μM prob stoğunun 1,2 μL'sini kullanın.
   4. Ön hibridizasyon çözeltisini çıkarın ve lamelleri nemlendirilmiş bir odaya aktarın.
      1. Tek tek damlacıklar oluşturmak için 30-50 μL prob solüsyonunu parafilm üzerine pipetleyin.
   5. Numuneleri gece boyunca (12-18 saat) 37 °C'de inkübe edin.

>GÜN 2

1. Lamelleri tekrar 12 oyuklu bir plakaya aktarın ve 37 °C'de 400 μL prob yıkama tamponu ile 4 x 5 dakika yıkayarak fazla prob solüsyonunu çıkarın.
   not: 30-50 μl'lik alikotları parafilm üzerine ve inkübasyon için lamellerin altına yerleştirmeye alternatif olarak, 300 oyuklu bir plakadaki lamellere doğrudan 12 μL prob çözeltisi ekleyin. Bu prosedür daha basittir ancak önemli miktarda reaktif gerektirir. Kullanmadan önce prob yıkama tamponunu 37 °C'ye ısıtın. Gereken tampon miktarını hesaplayın ve 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın.
2. Numuneleri RT'de 5x SSCT ile 2 x 5 dakika yıkayın.
3. 5x SSCT çözeltisini 1x PBS ile değiştirin ve numuneleri amplifikasyona kadar 4 °C'de saklayın.

3. Yükseltme

1. 1x PBS çözeltisini kuyucuklardan çıkarın ve her kuyucuğa en az 300 μL amplifikasyon tamponu ekleyin. Numuneleri RT'de 30 dakika inkübe edin.
2. Her bir HCR saç tokasını (h1 ve h2) istenen hacmi ayrı tüplerde çırparak soğutarak hazırlayın.
   1. 300 μL amplifikasyon çözeltisi hazırlamak için, her bir saç tokasından 18 pmol kullanın (örneğin, 300 μL için 6 μL 3 μM stok saç tokası çözeltisi kullanın).
   2. Saç tokası solüsyonunu tüplere aktarın.
   3. 95 °C'de 90 saniye inkübe edin.
   4. Karanlıkta 30 dakika RT yapmak için soğutun.
3. Çıtçıtla soğutulmuş "h1" ve "h2" saç tokalarını amplifikasyon tamponuna ekleyerek bir saç tokası karışımı hazırlayın.
4. Parafilm üzerine 30-50 μL saç tokası karışımından damlalar damlatın.
5. Numuneleri gece boyunca (12-18 saat) karanlıkta RT'de inkübe edin.

>GÜN 3

1. Lamelleri 12 oyuklu plakaya geri aktarın ve çalkalama ile RT'de 5x SSCT ile 5 x 5 dakika yıkayarak fazla saç tokalarını çıkarın.
2. 5x SSCT arabelleğini aspire edin ve 1x PBS.
   ile değiştirin not: Gerekirse, RNA-FISH örneklerini standart bir immünofloresan testinde kullanın ve ardından çekirdekler boyansın (bkz. bölüm 1.4).

4. Nükleer boyama ve kızak montajı

1. 1x PBS çözeltisini aspire edin ve 1x PBS çözeltisinde 4 ", 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 0.2 μg / mL) ile değiştirin.
2. Örnekleri karanlıkta RT'de 10 dakika inkübe edin.
3. DAPI solüsyonunu aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
4. Montaj ortamının her birine 10 μL'lik iki damla yerleştirin; iki lamel tek bir slayta yerleştirilmesine izin vermek için damlaların yeterince ayrıldığından emin olun.
5. Lamelleri temiz bir havluya vurarak fazla sıvıyı çıkarın ve ardından hücreler aşağı bakacak şekilde bir antifade montaj ortamına yerleştirin.
6. Monte edilen numuneleri karanlıkta kuru, düz bir yüzeye yerleştirin ve kürlenmelerine izin verin.
7. Sertleştikten sonra, numunelerin kurumasını önlemek için lamellerin kenarlarını VALAP dolgu macunu veya oje ile kapatın.

2. HAÖ kültürlerinde SARS-CoV-2 RNA-FISH

>GÜN 1

1. HAÖ kültürünün sabitlenmesi ve geçirgenliği
   1. Ortamı aspire edin ve enfekte olmuş hücreleri RT'de 1 saat boyunca% 3.7 PFA çözeltisi kullanarak sabitleyin.
   2. % 3.7 PFA çözeltisini aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
      1. %3,7 PFA çözeltisini bir Transwell eki altında 1x PBS ile değiştirin.
   3. PBS'yi atın ve numuneleri -2 ° C'ye önceden soğutulmuş %100 MeOH ile 2 x 5 dakikalık yıkamalar kullanarak kurutun.
   4. İkinci yıkamadan sonra, Transwell ekinin altında geçirgenlik için tamponu taze, soğutulmuş MeOH ile değiştirin. Gece boyunca -20 °C'de saklayın.

>GÜN 2

1. Rehidrasyon
   Numuneleri buz üzerinde kademeli bir dizi MeOH/PBST çözeltisi (her biri 5 dakika boyunca) ile yeniden sulandırın: %75 MeOH/%25 PBST, %50 MeOH/%50 PBST, %25 MeOH/%75 PBTS ve %100 PBST (iki kez).
   1. Hücreleri %50 5x SSCT/%50 PBST ile buz üzerinde 5 dakika yıkayın.
   2. Hücreleri 5x SSCT ile buz üzerinde 5 dakika yıkayın.
   3. 5x SSCT arabelleğini 1x PBS ile değiştirin.
2. Algılama
   1. Hücreleri (Transwell ekinin içinde) 100 μL prob hibridizasyon tamponu ile buz üzerinde 5 dakika inkübe edin. Daha sonra, plakayı 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir inkübatöre aktarın (ön hibridizasyon).
      not: Prob hibridizasyon tamponu, kullanımdan önce 37 °C'ye önceden ısıtılmalıdır. Gerekli hacmi hesaplayın: Tek bir Transwell kesici ucu için 100 μL gereklidir.
   2. Prob çözeltisini hazırlayın. 1 mL prob çözeltisi 4 pmol prob gerektirdiğinden, 1 mL prob hibridizasyon tamponuna 4 μL 1 μM prob stok çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.
      not: RNA tespiti için, Transwell eki başına 100 μL prob çözeltisi kullanın. Prob çözeltisini ön hibridizasyon adımının sonuna kadar buz üzerinde bırakın.
   3. Ön hibridizasyon çözeltisini çıkarın ve prob çözeltisini ekleyin.
   4. Hücreleri gece boyunca (12-18 saat) 37 ° C'de inkübe edin.

>GÜN 3

1. 37 °C'de 100 μL prob yıkama tamponu ile 4 x 15 dakika yıkayarak fazla probu çıkarın.
2. Numuneleri RT'de 5x SSCT ile 2 x 5 dakika yıkayın.
3. 5x SSCT'yi 1x PBS ile değiştirin ve numuneleri amplifikasyona kadar 4 °C'de saklayın.

1. Amplifikasyon

1. Numuneleri RT'de 30 dakika boyunca bir amplifikasyon tamponu ile inkübe ederek önceden amplifiye edin.
2. İstenilen hacimleri ayrı tüplerde hızlı bir şekilde soğutarak her bir saç tokasını hazırlayın.
   1. 500 μL amplifikasyon çözeltisi hazırlamak için, her bir saç tokasından 30 pmol kullanın (ör., 500 μL için 10 μL 3 μM stok saç tokası çözeltisi kullanın).
   2. Saç tokası solüsyonunu tüplere aktarın.
   3. 95 °C'de 90 saniye inkübe edin.
   4. Karanlıkta 30 dakika RT yapmak için soğutun.
3. RT'de 500 μL amplifikasyon tamponuna tüm çıtçıtlı soğutmalı saç tokalarını ekleyerek saç tokası çözeltisini hazırlayın.
4. Preamplifikasyon solüsyonunu çıkarın ve tam saç tokası solüsyonunu ekleyin.
5. Numuneleri gece boyunca (12-18 saat) karanlıkta RT'de inkübe edin.
6. RT'de 5x SSCT ile aşağıdaki gibi yıkayarak fazla saç tokalarını çıkarın: 2 x 5 dakika, 2 x 15 dakika ve 1 x 5 dakika.
7. 5x SSCT çözeltisini 1x PBS ile değiştirin ve 2-3 günden fazla olmamak üzere 4 ° C'de saklayın veya doğrudan nükleer boyamaya geçin.
   not: Gerekirse, RNA-FISH örneklerini standart bir immünofloresan testinde ve ardından nükleer boyamada kullanın (bkz. bölüm 3).

5. Nükleer boyama ve kızak montajı

1. 1x PBS çözeltisini aspire edin ve 1x PBS'de DAPI çözeltisi (0.2 μg / mL) ile değiştirin.
2. Örnekleri karanlıkta RT'de 10 dakika inkübe edin.
3. DAPI solüsyonunu aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
4. Transwell eklerinden kesilen membranı, hücreler yukarı bakacak şekilde 10 μL antifade montaj ortamına yerleştirin ve membrana ekstra montaj ortamı (5 μL) ekleyin.
5. Membranları lamellerle örtün.
6. Monte edilen numuneleri karanlıkta kuru, düz bir yüzeyde kürleyin.
7. Sertleştikten sonra, numunelerin kurumasını önlemek için lamellerin kenarlarını VALAP dolgu macunu veya oje ile kapatın.

3. Vero hücrelerinin ve HAE kültürlerinin immünofloresan analizi

NOT: İmmünofloresan testini hücre hatları için 3. günde veya HAE kültürleri için 4. günde gerçekleştirin. Her model için farklı bir yaklaşım kullanın. Tüm farklılıklar açıkça belirtilmiştir.

1. 1x PBS çözeltisini kuyulardan aspire edin.
2. Numuneleri, 37 ° C'de 30 dakika boyunca PBST çözeltisinde% 1 w / v sığır serum albümini ile inkübe ederek bloke edin.
3. Bloke edici çözelti içinde uygun seyreltmeler hazırlayarak birincil antikorları hazırlayın ve inkübe edin.
   1. Lamellerdeki Vero hücreleri için:
      1. Damla (30-50 μL) antikor solüsyonunu bir nem odasındaki parafilm üzerine yerleştirin.
      2. Lamelleri, hücreler aşağı bakacak şekilde antikor damlalarının üzerine yerleştirin.
   2. HAE için, eklerdeki bloke edici ajanı antikor çözeltisi (100 μL) ile değiştirin ve numuneleri nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
      NOT: Birincil antikor ile her inkübasyon için süreyi ve sıcaklığı ayarlayın. Tipik parametreler RT'de 2 saat veya gece boyunca 4 °C'dir.
4. Numuneleri PBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
   1. Lameller üzerindeki hücreler için, 12 oyuklu bir plakaya aktarın ve PBST çözeltisi ekleyin.
   2. HAÖ kültürleri için, antikor çözeltisini PBST çözeltisi ile değiştirin.
5. Konfokal mikroskop için mevcut ışık kaynaklarını ve filtreleri kontrol edin.
6. Konakçı türe göre ikincil antikorları seçin. Florofor parametrelerini seçin (uyarma ve emisyon dalga boyları, spektrum genişliği ve mevcut ışık kaynağına göre uyarma verimliliği).
   not: Spektral parametreler çevrimiçi araçlar kullanılarak modellenebilir (bkz. Malzeme Tablosu).
7. Uygun ikincil antikor çözeltilerini bir bloke edici çözelti ile seyrelterek hazırlayın.
8. İkincil antikorlarla inkübe edin (6.3'teki gibi), ancak 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
9. Numuneleri adım 3.4'teki gibi yıkayın.
10. Nükleer boyama ve kızak montajı
    1. Lamellerdeki hücreler için
       1. PBST'yi aspire edin ve 1x PBS çözeltisinde DAPI (0.2 μg / mL) ile değiştirin.
       2. Örnekleri karanlıkta RT'de 10 dakika inkübe edin.
       3. DAPI solüsyonunu aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
       4. Lamelleri, hücreler aşağı bakacak şekilde 10 μL montaj ortamı damlalarının üzerine yerleştirin.
       5. Lamelleri oje ile kapatın.
    2. HAÖ kültürleri için
       1. 1x PBST'yi aspire edin ve 1x PBS çözeltisinde DAPI (0.2 μg/mL) ile değiştirin.
       2. Örnekleri karanlıkta RT'de 10 dakika inkübe edin.
       3. DAPI solüsyonunu aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
       4. Kesilen membranları, hücreler yukarı bakacak şekilde 10 μL'lik montaj ortamının damlalarına yerleştirin ve zara fazladan (5 μL) bir montaj ortamı ekleyin.
       5. Membranları lamellerle örtün.
       6. Lamelleri oje ile kapatın.

4. Konfokal mikroskopi

1. Kullanılan floroforları belirterek izleri tanımlayın.
2. Tarama modunu ve hızını seçin.
3. Her florofor için lazer gücü, kazanç ve ofset değerlerini, ilgili negatif kontrollerle karşılaştırarak ayarlayın: virüs, sahte enfekte hücreler için; hücresel proteinler için, uygun bir konakçıdan izotip kontrol antikorları ile boyanmış numuneler.
4. Bir 3D görüntü elde etmek için z-stack modunu etkinleştirin ve üst ve alt sınırları ayarlayın. Adım boyutunu/sayısını ayarlayın.
   not: Koronavirüs görüntüleme hakkında daha fazla bilgi için.