İnsan Serumunda Nötralize Edici Antikor Titrelerini Ölçmek için Bir Mikronötralizasyon Testi

Özet

Kaynak: Gross, F. L. ve diğerleri, MDCK-SIAT1 Hücreleri Kullanılarak Mikronötralizasyon Testleri ile İnsan Serumlarında A(H3N2) Virüslerine Karşı İnfluenza Nötralize Edici Antikor Yanıtlarının Ölçülmesi.J. Vis. Uzm.(2017)

Bu video, insan serumunda α2,6'ya bağlı sialik asidi aşırı eksprese eden Madin-Darby Köpek Böbrek hücrelerini kullanarak nötralize edici antikorları ölçmek için Mikronötralizasyon testlerini göstermektedir. Bu test genellikle influenza insan serolojisi için kullanılır

Protokol

Tüm influenza virüsleri, Mikrobiyolojik ve Biyomedikal Laboratuvarlarda Biyogüvenlik'te (BMBL) tanımlanan uygun biyogüvenlik seviyesi gereksinimlerine (BSL-2 veya üstü) göre ele alınmalıdır.

1. Reaktiflerin ve Başlangıç Malzemesinin Hazırlanması

1. Madine Darby Köpek Böbrek-α2,6-siyal transferaz (MDCK-SIAT1) hücrelerini ve steril hücre kültürü ortamını hazırlayın
   1. Yüksek glikozlu 500 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), v/v ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 1 mg/mL G418 sülfat (örn., genetikin) ve 100 μg/mL streptomisin (isteğe bağlı) ile 100 U/ml penisilin kullanarak MDCK-SIAT1 hücre kültürü ortamını hazırlayın. 0,2 μM gözenek boyutunda bir zardan süzülerek sterilize edin. MDCK-SIAT1 hücrelerinde plazmit stabilitesini sağlamak için G418 sülfat eklenir.
   2. MDCK-SIAT1 hücre hattını hazırlayın. 30 mL steril hücre kültürü ortamı içeren 162^cm2'lik bir doku kültürü şişesinde, 2 - 2.5 x 10⁶ MDCK-SIAT1 hücreli tohum şişeleri ve 37 °C'de% 5 CO₂ içinde 2 gün inkübe edin; bu, doku kültürü enfeksiyöz doz (TCID) tayini ve MN tahlilleri için kullanılacaktır.
      not: MDCK-SIAT1 hücreleri, Dr. M. Matrosovich, Marburg, Almanya tarafından nazikçe sağlandı. Bu hücre hattı ticari olarak da elde edilebilir (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. 500 mL DMEM yüksek glikoz,% 0.3 sığır serum albümini (BSA) fraksiyonu V, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve 20 mM N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) kullanarak steril virüs yayılma ortamını hazırlayın. 0,2 μM gözenek boyutunda bir zardan süzülerek sterilize edin.
3. pH 7.2'de 0.01 M PBS içeren fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 0.75 (h / h) kobay kırmızı kan hücreleri (gpRBC'ler) hazırlayın.
4. Steril virüs seyrelticiyi DMEM yüksek glikoz,% 1 Sığır Albümin Fraksiyonu V (BSA), 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve 20 mM HEPES kullanarak hazırlayın. 0,2 μm gözenek boyutunda bir membran ile süzülerek sterilize edin ve her test için taze olarak hazırlayın.
5. Soğuk hücre sabitleyicisini
12. 2. 2. 
          

2. 
   

3. 
   
7. 3. 2. 
         
8. 1. 
      
      

2. 
   
3. 2. 1. 
         
      2. 
         
4. 3. 3. 
         
         
      4. 
         
   4. 
      

1. 3. 
      
   4. 
      
4. 2. 1. 
         
   3. 1. 
         
5. 
   
   1. 1. 
         
         
   3. 
      

Sonuçlar

Şekil 1. MDCK-SIAT1 hücre kültürü.MDCK-SIAT1 hücreleri. (A) Virüs aşılaması için MDCK-SIAT1 birleşik tek tabaka (%>100 birleşim); (B) TCID₅₀ ve MN deneyleri için% 75 - 95 birleşme ile log fazında MDCK-SIAT1 hücreleri.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun yüksek Glikozlu Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)	Yaşam Bilimleri	11965	Steril Hücre Kültürü, Virüs Yayılımı ve Virüs Seyreltici Ortamın kritik bir bileşeni
Fetal sığır serumu (FBS)	Klon	SH30070.03
Sığır Serum Albümini (BSA) Fraksiyon V, Protaz İçermez	Sigma-Aldrich	3117332001
L-Glutamin	Yaşam Bilimleri	25030-081
Sodyum piruvat	Yaşam Bilimleri	11360-070
Geneticin G-418 disülfat tuzu	Sigma-Aldrich	A1720-5G
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Yaşam Bilimleri	15630-080
Penisilin / Streptomisin	Yaşam Bilimleri	15140-122
aseton	VWR (VWR)	67-64-1	%80 konsantrasyonda kullanılır
Sodyum Perborat ile Fosfat-Sitrat Tamponu	Sigma-Aldrich	SLBF2806V
O-Fenilendiamin Dihidroklorür tableti	Sigma-Aldrich	SLBQ1086V	100 ml hücre kültürü dereceli su başına 1 tablet
Sülfürik Asit	Balıkçı Bilimsel	A510-P500	Kullanılan 0.5M nihai konsantrasyon
Etanol, denatüre, 4L	VWR (VWR)	EM-AX0422-3	%70 konsantrasyonda kullanılır
Tripsin-EDTA	Yaşam Bilimleri	1748048
RDE II "Seiken"	Denka Seiken	370013
Ara 20	Sigma-Aldrich	P1379-500ml
Anti-NP fare monoklonal Ab	Millipore havuzu	MAB 8257 MAB 8258
Anti-fare IgG HRP	KPL (Türkçe)	074-1802
96 kuyucuklu düz tabanlı plakalar	Termo Bilimsel	3455
Plaka okuyucu	Moleküler Cihaz	Spektromax 384 artı
Hücre Kültürü Şişesi 162 cm2/Havalandırma Kapağı	Corning/VWR	3151

Adet Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi · Gazetesi adet