İmmün Ortaya Çıkarma Üzerine Arabidopsis Yaprak Disklerinde Oksidatif Patlamayı Tespit Etmek İçin Bir Test

Özet

Kaynak: Bredow, M., et al. Arabidopsis thaliana'da Modelle Tetiklenen Oksidatif Patlama ve Fide Büyüme İnhibisyonu Testleri. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, immün elisyon üzerine Arabidopsis yapraklarındaki oksidatif patlamayı ölçmek için yapılan bir testi göstermektedir. Bitki yapraklarından kesilen yaprak diskleri, mikropla ilişkili moleküler desenler veya MAMP'lar olarak işlev gören bakteriyel peptitlerle inkübe edilir. MAMP'ların tespiti üzerine, bitki hücreleri, bir kemilüminesans testi kullanılarak tespit edilen hücre dışı ROS üretimini indükler.

Protokol

1. İmmün ortaya çıkmayı takiben Arabidopsis yaprak disklerinde ROS patlamasının tespiti

1. Bitki büyümesi ve bakımı.
   1. Çimlenmeyi senkronize etmek için, Arabidopsis tohumlarını 1 mL steril% 0.1 agar [w / v] içinde yaklaşık 50 tohumu süspanse ederek tabakalandırın ve 3-4 gün boyunca 4 ° C'de (ışıksız) saklayın.
      not: Dahili kontroller olarak hizmet etmek için vahşi tip bir arka plan kontrolünü (örneğin, Col-0) ve yüksek ve düşük bağışıklık çıkışlarına sahip genotipleri (örneğin, sırasıyla cpk28-1 ve bak1-5) sınıflandırın.
   2. Toprağa tohum ekin ve standart kısa gün koşullarında (22 °C, 10 saat ışık, 150 μE/^m2/s ışık yoğunluğu ve %65-70 bağıl nem) çimlenin.
   3. Yaklaşık 7 gün sonra, tam rozet gelişimine izin vermek için tek tek fideleri en az 4 cm ayrılmış yeni saksılara nakletmek için forseps kullanın. Genotip başına 6-12 fidan nakledin ve standart kısa gün koşullarına dönün. Bitkileri düzenli olarak sulayın ve gübreleyin (her 2 haftada bir 1 g/L 20-20-20 gübre).
2. Gece boyunca geri kazanım için yaprak diskleri 96 oyuklu plakalarda toplayın.
   1. Çimlenmeden 4-5 hafta sonra (Şekil 1A), bitki başına bir yaprak diskini çıkarmak için 4 mm'lik keskin bir biyopsi zımbası kullanın, orta damardan kaçının ve yarayı sınırlamaya dikkat edin (Şekil 1B). Yaprak diskleri, kurumayı önlemek için adaksiyal tarafı yukarı bakacak şekilde 96 μL çift damıtılmış su (_ddH100O) içeren kullanılmayan 2 oyuklu bir luminometre plakasına yerleştirin (Şekil 1C). Birden fazla elisitörü değerlendiriyorsanız, her bir elisitör tedavisi için aynı yapraktan 1 yaprak diski çıkarın.
      not: Tamamen genişlemiş, rozetin tepesinden üçüncü ila beşinci ve değişkenliği sınırlamak için yaklaşık olarak aynı boyut ve yaşta olan örnek yapraklar. Mümkünse, gece boyunca toparlanmadan önce bir tıraş bıçağı kullanarak yaprak diskleri ikiye bölün, çünkü bu, elisitör çözeltisine maruz kalan yüzey alanını artırır.
   2. Yaprak diski toplama sırasında yaralama tarafından üretilen ROS'un girişimini önlemek için gece boyunca oda sıcaklığında iyileşin. Buharlaşmayı önlemek için plakaları bir kapakla örtün.
3. Elisitör işlemini gerçekleştirin ve ROS üretimini ölçün.
   1. Reaksiyon çözeltisini eklemeden önce plaka okuyucuyu programlayın, çünkü bu, ROS patlamasının başlaması ile kaydedilen ilk ölçümler arasındaki süreyi azaltacaktır. Plaka okuyucu için uygun olan ticari bir yazılım kullanın. Bizim durumumuzda (İçindekiler'e bakın), Ayarlar'a tıklayın ve LUM96 Kartuşunu ve Kinetik Okuma Türünü seçin. Okuma Alanı kategorisini tıklatın ve okunacak kuyucukların bir alt kümesini veya plakanın tamamını seçmek için sürükleyin. PMT ve Optik sekmesi altında, entegrasyon süresini 1.000 ms olarak ayarlayın. Zamanlama sekmesi altında, Toplam Çalışma Süresi'ni 40-60 dakika ve Aralık'ı 2 dakika olarak ayarlayın.
   2. Çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyudan suyu alın.
      not: Yaprak diskleri delmeyin, çünkü bu yaralanma stresine neden olabilir ve daha değişken ROS çıkışlarına neden olabilir.
   3. 100 μM luminol, 10 μg/mL yaban turpu peroksidaz (HRP) ve istenen elicitor konsantrasyonunu içeren bir reaksiyon çözeltisi hazırlayın (örneğin: 1 nM, 10 nM, 100 nM veya 1.000 nM'de elf18) steril ddH 2O'da 96 oyuklu bir plaka için10 mL çözelti kullanarak.
      not: Liyofilize peptitleri 10 mM'lik bir stok yapmak için düşük bağlayıcı tüplerde steril H₂O içinde çözün, sıvı_N2'de hızlı dondurun ve -80 ° C'de saklayın. Kullanıma hazır olduğunda, 100 μM'lik bir çalışmastoğu oluşturmak için stokları steril H 2O'da seyreltin ve -20 °C'de saklayın.
   4. Her bir oyuklu alana 100 μL reaksiyon karışımı dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve çözeltiyi aynı işlemin tüm yaprak disklerine aynı anda ekleyin. Ortaya çıkma yokluğunda bazal ROS seviyelerini değerlendirmek için her genotip için bir kontrol reaksiyonu (elisitör yok) ekleyin. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak görünür spektrumdaki tüm dalga boyları için ışık emisyonunu hemen ölçün.
      not: Luminol ve HRP ışığa duyarlı reaktifler olduğundan, reaksiyon çözeltisini düşük ışık altında hazırlayın ve uygulayın. Kullanılmadığı sürece reaktifleri buz üzerinde veya -20°C'de tutun.
   5. Dinamik oksidatif patlamayı yakalamak için bir mikroplaka okuyucuda 40-60 dakikalık bir süre boyunca 2 dakikalık aralıklarla 1.000 ms'lik bir entegrasyon süresiyle ışık emisyonunu ölçün (Şekil 1D).
      not: 96 oyuklu bir plakadaki tüm numunelerin tek bir aralıkta ölçülebilmesini sağlarken tahlil hassasiyetini artırmak için daha uzun bir entegrasyon süresi kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1. Arabidopsis'te immün indüksiyonu takiben luminol bazlı oksidatif patlama testi. (A) Bitkileri 4-5 hafta boyunca kısa gün koşullarında toprakta yetiştirin. (B) Her bitkiden yaprak diskleri toplamak için 4 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanın ve gece boyunca ddH2O'da iyileşin. (C) Reaksiyon çözeltisi (100 μM luminol, 10 μg/mL HRP ve istenen elisatör konsantrasyonu) ekleyin ve 1.000 ms'l...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
20-20-20 Gübre	Bitki Ürünü	10529	1 g / L suda karıştırın ve optimum büyüme için her 2 haftada bir bitkilere uygulayın.
4 mm Biyopsi Punch	Medikal Mart	232-33-34-P	0,125 cm^2 yüzey alanına sahip bir mantar delici seti de kullanılabilir.
BioHit mLine Mekanik 12 Çok Kanallı Pipet (30-300 uL)	Sartorius	725240	Herhangi bir çok kanallı pipet ve gerekirse tek bir pipetleyici kullanılabilir.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biyolaboratuvar	CP7211	10 mM stok peptidi -80 ° C'de düşük protein bağlayıcı tüplerde saklayın. Çözüldüğünde 100 uM çalışma stoğunu -20C'de saklayın.
Forseps	Balıkçı Bilimsel	22-327379
Yaban turpu peroksidaz	Sigma-Aldrich	P6782 Serisi	Saf suda çözülür. -20C'de ve ışıktan uzakta saklayınız.
Aydınlatma	Sigma-Aldrich	A8511	DMSO'da çözün. -20C'de ve ışıktan uzakta saklayınız.
Murisage ve Skoog Bazal Tuzları	Cedarlane Laboratuvarları	MSP09-100LT	4C'de saklayın.
toprak	SunGrow Bahçe Bitkileri	Güneş Işığı Karışımı #1	Arabidopsis yetiştirmek için diğer toprak türleri de kullanılabilir. Tencereleri doldururken su ile karıştırın.
LUM Modüllü SpectraMax Paradigma Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu	Moleküler Cihazlar		Bu tahliller için lüminesansı tespit edebilen herhangi bir plaka okuyucu kullanılabilir.
Beyaz Polistiren 96 Kuyucuklu Plakalar	Balıkçı Bilimsel	07-200-589

Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi