Fide büyümesinin bağışıklık kaynaklı inhibisyonunun ölçülmesi

Özet

Kaynak: Bredow, M. ve ark., Arabidopsis thaliana'da Modelle Tetiklenen Oksidatif Patlama ve Fide Büyüme İnhibisyonu Testleri. J. Vis. Uzm. (147),(2019).

Bu video, Arabidopsis thaliana bitkisindeki fide büyüme inhibisyonu testini göstermektedir. Artan immün peptit elisitör konsantrasyonunun fide büyümesi üzerindeki etkisi belirlenir.

Protokol

1. Fide Büyüme İnhibisyon Testi

1. Tohumları sterilize edin ve Murashige ve Skoog (MS) plakalarına ekin.
   1. % 0.8 agar [a / h] içeren steril yarı mukavemetli (0.5x) MS ortamı (2.16 g / L) hazırlayın. Ortamı laminer akış başlığındaki plakalara (90 x 15 mm) dökün.
   2. Yaklaşık 100 tohumu bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL p etanol ile 2 dakika yıkayarak sterilize edin ve aspirasyon ile çıkarın. 1 mL @ çamaşır suyu ekleyin ve oda sıcaklığında 17 dakika hafifçe sallayın. Çamaşır suyunu aspirasyon ile çıkarın ve 1 mL steril suda 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. 1 mL steril% 0.1 agar.
      içinde tekrar süspanse edin not: Alternatif olarak, bir klor gazı tohumu sterilizasyon protokolü kullanın24.
   3. Bir pipet kullanarak MS agar plakalarına genotip başına yaklaşık 100 tohum ekin ve laminer akış başlığında mikro gözenekli bantla kapatın.
      not: Tohumları yakına koymaktan kaçının çünkü bu, fidelerin daha sonra dikilmesini zorlaştıracaktır.
   4. Çimlenmeyi senkronize etmek için plakaları 3-4 gün boyunca 4 °C'de (ışıksız) yerleştirerek tohumları tabakalandırın (Şekil 1A).
2. Fideleri, immün elisitör peptitler içeren 48 oyuklu plakalara nakledin.
   1. Tabakalaşmadan sonra, çimlenmeye izin vermek için plakaları kısa gün koşullarında (22 °C, 10 saat ışık, 150 μE/^m2/s ışık yoğunluğu ve e-70 bağıl nem) 3-4 gün boyunca ışığa getirin.
   2. Laminer akış başlığında, her 48 oyuklu plaka için 25 mL MS kullanarak% 1 sakaroz [a / h] içeren steril 0.5x MS sıvı ortamda elisitör peptit seyreltmelerini (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM ve 1.000 nM) hazırlayın. Oyuk başına 500 μL MS sıvı ortamı veya MS ortamı içeren peptitleri pipetleyerek plakaları hazırlayın. Varsa, işlemi hızlandırmak için plaka hazırlama için bir tekrar pipetleyici kullanın.
      not: Her genotip için, fide büyümesindeki herhangi bir doğal farklılığı hesaba katmak için elicitor olmadan MS'de fide yetiştirin.
   3. Steril forseps kullanarak, aynı boyut ve yaştaki her bir oyuğa bir fideyi dikkatlice nakledin, fideye zarar gelmediğinden veya kökte kırılma olmadığından ve kökün ortama batırıldığından emin olun. Her genotip için, her bir peptit seyreltmesine en az 6-8 fide nakli (Şekil 1B).
      not: Fideleri çimlenmeden 4 gün sonra nakledin, çünkü kısa köklerin manipüle edilmesi daha kolaydır ve daha yaşlı fideler daha az optimal sonuçlar verebilir.
   4. Plakaları mikro gözenekli bantla kapatın ve standart kısa gün koşullarında (22 °C, 10 saat ışık, 150 μE/^m2/s ışık yoğunluğu ve e-70 bağıl nem) tekrar ışığa getirin. Fidelerin 8-12 gün büyümesine izin verin.

2. Büyüme inhibisyonunun yüzdesini belirleyin.

1. Fideleri 48 oyuklu plakalardan dikkatlice çıkarın ve bir kağıt havluya sürerek kurulayın. Fideleri analitik bir ölçekte tartın ve değerleri kaydedin. Varsa, yeni ağırlık değerlerini bir elektronik tabloya kaydetmek için USB çıkışına sahip bir analitik terazi kullanın. Fideleri tartmadan önce, büyüme inhibisyonunu görsel olarak göstermek için bir fotoğraf çekin (Şekil 1C).
2. MS'de yetiştirilen fidelere kıyasla elisitör ile muamele edilen fidelerin büyüme inhibisyonunun yüzdesini yalnızca aşağıdaki gibi belirleyin:
   
3. Deneyler arası varyansı daha iyi görüntülemek için standart hata çubuklarına sahip bir çubuk grafik veya bir kutu ve yatay çizgi grafiği kullanarak verileri çizin.

Sonuçlar

Şekil 1. Arabidopsis'te elisitörün neden olduğu fide büyüme inhibisyonu testi. (A) Fideleri MS agar'a ekin ve standart kısa gün koşullarında 3-4 gün boyunca büyütün. (B) Fideleri MS ortamı veya farklı konsantrasyonlarda elf18 içeren MS içeren 48 oyuklu plakalara nakledin. (C) 8-12 gün sonra, fide boyutunu görsel olarak değerlendirin ve ardından büyüme inhibisyonunu belirlemek için analitik bi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
8 Kuyulu Kapaklı Steril Plakalar	Sigma-Aldrich	CLS3548
Taslak Sheid ile Analitik Ölçek	VWR (VWR)	VWR-225AC	Büyüme başlatma testleri için herhangi bir standart analitik terazi kullanılabilir, ancak doğrudan bir bilgisayar çıktısı en uygunudur.
BioHit mLine Mekanik 12 Çok Kanallı Pipet (30-300 uL	Sartorius	725240	Herhangi bir çok kanallı pipet ve gerekirse tek bir pipetleyici kullanılabilir.
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biyolaboratuvar	CP7211	10 mM stok peptidi -80 ° C'de düşük protein bağlayıcı tüplerde saklayın. Çözüldüğünde, 100 uM çalışma stoğunu -20 ° C'de saklayın.
Murisage ve Skoog Bazal Tuzları	Cedarlane Laboratuvarları	MSP09-100LT	4 ° C'de saklayın.
Beyaz Polistiren 96 Kuyucuklu Plakalar	Balıkçı Bilimsel	07-200-589

Gazetesi Serisi Serisi