NOT: Protokol farklı bitki dokularına uygulanabilir. Bu protokolde PAMP ortaya çıktıktan sonra ROS tespiti için pirinç kılıfı ve yaprak diskleri kullanılmıştır. Farklılıklar esas olarak örnekleme yöntemine bağlı olarak ortaya çıktığından, aşağıda yalnızca ortak prosedürler açıklanmıştır ve gerektiğinde belirli adımlara değinilmiştir.
1. Doku hazırlama ve ön işlem
- Pirinç kılıfı
- ROS testinden 1 gün önce ön işlem için 10 günlük pirinç fidelerinin kılıfını keskin bir tıraş bıçağı veya cerrahi bıçakla 3 mm'lik segmentler halinde kesin (Şekil 1B).
- Karanlıkta 25 °C'de 10-12 saat boyunca 100 μL çift damıtılmış su (ddH2O) içeren 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının ayrı bir kuyusuna beş kılıf segmenti yerleştirin, bu da yara yaralanmasına bağlı iyon sızıntısına ve savunma tepkilerinin azalmasına izin verir (Şekil 2).
not: Ortaya çıkarma çözeltisine maruz kalan tutarlı bir kesme yüzeyi alanı sağlamak için kesimleri dikey tutmaya özen göstermek, yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için önemli bir adımdır. Segmentleri yavaşça hareket ettirin. Segmentler üzerinde fazladan kesikler veya yaralar yapmayın, bu da veri varyasyonu kaynağı olabilir. Prensip olarak, ROS değerinin değişimi büyük olduğu için her test en az beş kopya içermelidir. Ne kadar çok çoğaltma ayarlanırsa, veriler o kadar güvenilir olur.
- Yaprak disk
- 4-6 haftalık pirinç bitkilerinden yaprak disklerini (4 mm çapında) bir pistonlu biyopsi zımbası kullanarak kesin. Veri değişimini azaltmak için yaprak disklerini her zaman ana yekenin ikinci kanadının orta üçte birlik kısmından (üstten numaralandırılmış) kesin (Şekil 1C).
- Ön tedavi için 10-12 saat boyunca 100 μL ddH2O içeren 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının ayrı bir kuyucuğuna bir yaprak diski yerleştirin, bu da yara ile ilgili yanıtların azalmasına izin verir, çünkü bunlar PAMP'lar tarafından ROS indüksiyonuna müdahale edebilir (Şekil 2).
not: Yaprak diskleri nazikçe çalıştırın. Deneyde diskler üzerinde fazladan kesik veya yara yapmayın, bu da veri farklılıklarına neden olabilir. ROS'un indüksiyonu çoğunlukla kesme kenarının hücrelerinden gerçekleşir, çünkü pirinç dokularının yüzeyleri (yapraklar veya kılıflar) hidrofobik tabakalarla kaplıdır. Sadece kesilen kenarların hücreleri ortaya çıkarma çözeltisi ile temas halindedir (tartışma bölümüne bakın).
- Yaprak tarafı ile ilişkili varyasyonu önlemek için su ön işlemi için bir mikrotitre plakasının kuyularında tüm yaprak disklerini, abaksiyal yüzey yukarı bakacak şekilde yüzer halde tutun.
2. Ortaya çıkarma çözeltisinin hazırlanması
- Stok çözeltisini yapmak için L-012 tozunu 20 mM (6.23 mg / mL) sulu çözelti içinde ddH2O ile çözün. Daha sonra, çalışma çözeltisini 500 μM L-012'nin nihai konsantrasyonunda yapmak için stok çözeltisini 50 mM Tris HCl tamponu (pH 7.5) ile seyreltin. Stok çözeltisini donmuş halde tutun ve kullanmadan önce çalışma çözeltisine seyreltin.
- PAMP, L-012 ve yaban turpu peroksidaz (HRP; ddH2O'da 10 mg / mL) içeren ortaya çıkarma solüsyonunu hazırlayın. 10 mL'lik bir açığa çıkarma çözeltisi için, 9.4 mL 50 mM Tris HCl (pH 7.5) çözeltisi, 400 μL L-012 çözeltisi, 100 μL HRP ve 100 μL flg22'yi karıştırın (PAMP; ddH2O'da 10 mM). Negatif kontrol için PAMP.
yerine 100 μL ddH2O ekleyin.
not: Pirinç dokuları üzerinde soğuk stresini önlemek için hazırlanan ortaya çıkarma çözeltilerini oda sıcaklığında tutun. Gerektiğinde kitin (son konsantrasyonda 20 ng/mL) gibi diğer PAMP'lar da tedavi için kullanılabilir. L-012 ışığa duyarlı olduğu için L-012 solüsyonu içeren tüm tüpleri alüminyum folyo ile kaplayınız.
>3. Yazılımın başlatılması ve referans alınan mikroplaka okuyucu ile protokolün kurulması (bkz. Malzeme Tablosu)
NOT: Mikroplaka okuyucu yazılımının parametrelerinin ayarlanması biraz zaman alır. Ortaya çıkarma çözümünü eklemeden önce makineyi ve protokolü hazırlamanız (devam etmek için tek bir tıklama) önerilir.
- Yazılımı başlatın. Yeni bir protokol oluşturmak veya mevcut bir protokolü kullanmak için Deneyler düğmesine tıklayın.
- Plakayı ayarlamak için açılır penceredeki Prosedür'e tıklayın. İzlenecek plakadan kuyuları seçin.
- Toplam çalışma süresini ve okuma aralığını ayarlamak için Kinetiği Başlat'a tıklayın. Deneysel gereksinimlere bağlı olarak Çalışma süresini 35 dakika veya daha uzun bir süre olarak ayarlayın. Mümkün olduğunca sık okumalar elde etmek için Minimum Aralık'ı seçin. Entegrasyon süresi için, sinyal yoğunluğuna bağlı olarak 1 s veya daha uzun bir süre seçin.
NOT: Okuma aralığı, örnek sayısına ve sinyal entegrasyon süresine bağlıdır.
- Doğrula'ya tıklayın | Ayarları onaylamak için Tamam'a basın.
- Açılır pencerede Yeni plakayı algıla'ya tıklayın ve yazılımın yük plakası iletişim kutusunu istemesini bekleyin. Test edilecek plakayı taşıyıcının üzerine yerleştirin.
- Ortaya çıkarma sisteminin kurulmasını beklemek için burada durun (bir sonraki bölümde). Ortaya çıkarma sistemi hazır olur olmaz, okumaya başlamak için Çalıştır'a tıklayın.
4. Ortaya çıkarma sisteminin kurulması ve gerçek zamanlı ROS üretiminin ölçülmesi
- Herhangi bir doku hasarını veya kurumasını önleyerek, ddH2O'yu önceden işlenmiş dokuları içeren oyuklardan dikkatlice çıkarın.
- Dokuları içeren oyuklara 200 μL ortaya çıkarma solüsyonu eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
- Karıştırmak için hafifçe sallayın. Algılamayı başlatmak için Çalıştır'a tıklayın.
not: PAMP tedavisi ile bitki dokuları çok hızlı bir şekilde yanıt verir ve ROS üretir. Bu nedenle, birden fazla tedavi olduğunda ameliyat süresini azaltmak için önce PAMP'sız negatif kontrolün tedavi edilmesi önerilmektedir. Tedaviler arasındaki ortaya çıkma gecikmesini azaltmak için mümkün olduğunca çabuk çalışın. Ortaya çıkarma çözeltisinin eklenmesi ile tespitin başlaması arasındaki süre ne kadar kısa olursa, önemli deneysel verilerin yakalanması o kadar iyi olacaktır.
