Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Periferik Kan Mononükleer Hücre İzolasyonu
- Asit-sitrat-dekstroz (ACD) antikoagülan (sarı tepeli tüpler) içeren vakutainerler kullanarak sağlıklı bir donörden veya bir hastadan venipunktur yoluyla insan tam kanı elde edin.
not: Tam kan, bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığında (18-22 ° C) 36 saate kadar ACD'de saklanabilir. Normalde, test için 1-2 adet 10 mL'lik tam kan vakum tüpü yeterlidir.
- Tam kanı 1: 1 v / v ılık tam RPMI ortamında seyreltin (RPMI-1640, %10 fetal sığır serumu, 20 mM HEPES ve 0.01 mg / mL gentamisin ile desteklenmiştir).
- Periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler), üretici tarafından önerildiği şekilde yoğunluk gradyan santrifüjleme kullanarak seyreltilmiş tam kandan izole edin (Bkz. Malzeme Listesi). Seyreltilmiş kanı yoğunluk gradyanı üzerine çok yavaş bir şekilde katmanlayın (oda sıcaklığına, 18-22 ° C'ye ısıtılmış).
not: Kanın en iyi şekilde ayrılması için kan karışımını damla damla dikkatlice katmanlayarak veya bir pipet kullanarak arayüzdeki karıştırma miktarını en aza indirin.
- Pipet ucunu yoğunluk gradyanına yakın yerleştirerek ve kan karışımının tüpün yanından çok yavaş bir şekilde akmasını sağlayarak kan karışımının yoğunluk gradyanının üstüne yavaşça katmanlanmasına izin verin.
- Deneyin ölçeğine bağlı olarak, 3 mL yoğunluk gradyanının (15 mL'lik bir tüpte) üzerine 10 mL kan karışımı tabakası veya 15 mL yoğunluk gradyanının (50 mL'lik bir tüpte) üzerine 35 mL kan karışımı tabakası. Tipik olarak, 10 mL tam kan, bazı donörden donöre varyasyonlarla birlikte 10 milyon PBMC verir.
not: Kan karışımının yoğunluk gradyanı ile karıştırılmaması çok önemlidir. Kan karışımı, yoğunluk gradyanı üzerinde katmanlanmalı ve tüm kan yoğunluk gradyanının üzerine gelene kadar yavaşça yükselmelidir.
- Katmanlı karışımı 700 x g'da frensiz 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlenmiş karışım 5 katmana (yukarıdan aşağıya) ayrılmalıdır: plazma, buffy coat (PBMC'ler içeren), yoğunluk gradyanlı malzeme, granülositler ve RBC'ler.
- Plazmanın büyük bir kısmını çıkarıp atın ve buffy coat (PBMC) içeriğini bir Pasteur pipeti ve bir vantuz kullanarak 15 mL'lik yeni bir tüpe dikkatlice alın.
not: Buffy coat tabakasının çıkarılması, pipetin ucu tüpe değecek şekilde tabakanın dışında dairesel bir hareket gerçekleştirirken Pasteur pipetine emme uygulanarak etkili bir şekilde yapılır.
- İzole edilmiş PBMC'leri, yıkamalar arasında 10 dakika boyunca (tam frenlerle) 350 x g'da santrifüjleyerek pH 7.3 fosfat tamponlu salin (PBS) içinde üç kez yıkayın. PBMC peletini tam RPMI ortamında sulandırın. Peletin boyutuna bağlı olarak, 3-7 mL ortam yeterlidir.
- Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak PBMC'yi sayın. Sadece tripan mavisi tarafından lekelenmemiş hücreleri sayın. PBMC'leri tam bir RPMI ortamında 1.750.000 hücre / mL'ye yeniden oluşturun.
- 8 odacıklı bir slaytın her bir oyuğuna 400 μL (700.000 hücre) tohumlayın. Monosit / makrofajların yapışmasını sağlamak için slaytı 37 ° C, tamamen nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe (% 5 CO2 ile desteklenmiş) 1 saat inkübe edin.
2. Yapışık Monositlerin Ön İşlemi
>NOT: Bu adım yalnızca fagositozu engellemenin veya geliştirmenin yollarını arıyorsanız gereklidir.
- Yapışan monositleri herhangi bir ilaç (lar) veya bileşik (ler) ile ön işlemden geçirin. İlaç(lar)ı veya diğer test materyalini tam bir RPMI ortamı kullanarak istenen konsantrasyona yeniden sulandırın.
not: Örneğin, 200 μg/mL IVIG tipik olarak insan monositleri kullanılırken fagositozun %95-100 inhibisyonu elde etmek için kullanılır.
- 1 saatlik inkübasyondan sonra (adım 1.6'dan sonra) 8 odacıklı slayttan herhangi bir yapışmayan hücre içeren süpernatanı aspire edin ve atın. 400 μL bir ilaç veya başka bir tedavi ile değiştirin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- 8 odacıklı kızaktaki çözeltileri aspire ederken ve değiştirirken, zayıf yapışmış hücrelerin kalkmaması için sıvıların akışını kontrol ettiğinizden emin olun. Ayrıca, bir seferde sadece 2-3 boş kuyu ile çalışın ve kuyuları kurutmaktan kaçının.
not: Tipik olarak, her tedavi teknik üçlüler halinde gerçekleştirilir.
3. R2R2 Kırmızı Kan Hücrelerinin Opsonizasyonu
NOT: Opsonized R2R2 RBC'ler, FcγR aracılı fagositoz için pozitif bir kontrol olarak kullanılır. Naif R2R2, Alsever'in solüsyonunda (raf ömrünü uzatmak için) 4 °C'de 1 aya kadar saklanmalıdır. Alsever'in solüsyonu kendi bünyesinde üretilir ve %0,8 w/v trisodyum sitrat (dihidrat), %1,9 w/v dekstroz, %0,42 w/v sodyum klorür ve %0,05 w/v sitrik asitten (monohidrat) oluşur. R2R2 hücreleri mevcut değilse, R1R2, R1R1, R1r veya R2r gibi diğer Rh fenotipli hücreler kullanılabilir.
- R2R2 (cDE / cDE) kırmızı kan hücrelerini PBS'de her biri 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleme kullanarak toplam üç kez yıkayın.
not: İhtiyaç duyulan RBC miktarı deney boyutuna bağlıdır ve geriye dönük olarak hesaplanabilir. Her zaman fazla miktarda RBC'yi yıkayın, çünkü RBC'ler her yıkama sırasında lizis nedeniyle veya süpernatantın çıkarılması sırasında kaybolur. Örneğin, tümü teknik üçlü olarak gerçekleştirilen 5 tedavi ve 2 kontrol ile yapılan bir deneyde toplam 21 kuyu vardır. 400 μL/kuyu %1.25 RBC karışımına sahip 21 kuyu, 105 μL paketlenmiş, opsonize edilmiş RBC'ye ihtiyaç olduğunu göstermektedir. Fagositoz basamağı için yeterli miktarda RBC olduğundan emin olmak için başlangıçta 200 μL RBC yıkanmalı ve 150 μL opsonize edilmelidir.
- Yıkanmış R2R2 peletini insan serumundan 1: 1 v / v poliklonal anti-D antikorları ile opsonize edin ve aralıklı karıştırma ile 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
not: Poliklonal anti-D antikorları mevcut değilse, ticari olarak temin edilebilen monoklonal anti-D antikorları veya normalde Rh immün profilaksisi için kullanılan, kan bankalarından veya transfüzyon hizmetlerinden elde edilebilen anti-D kullanmak mümkündür. Optimizasyon testi, testi ayarlarken başlangıçta ve çok sayıda titresiz poliklonal antikor değiştirilirken veya bir monoklonal antikora geçilirken yapılmalıdır. Bu, 3+ ile 4+ arasında bir antiglobulin testi (IAT) sonucu ve sayılan 100 monosit başına 70-90 fagositozlu RBC arasında bir fagositoz sonucu için gerekli olan optimal anti-D konsantrasyonunu veya hacmini belirlemek içindir.
- Opsonized R2R2'yi PBS'de 350 x g'da santrifüjleme kullanarak her biri 5 dakika boyunca toplam üç kez yıkayın.
not: R2R2'nin başarılı opsonizasyonu, dolaylı bir IAT gerçekleştirilerek doğrulanabilir. Kısaca, RBC yüzeylerindeki primer opsonize edici antikorları bağlamak için sekonder poliklonal anti-insan antikorları eklenir ve amplifiye edilmiş sinyal hemaglutinasyon şeklinde gözlenebilir. Ayrıntılı bir üretici protokolü ek malzemeler dosyasında bulunabilir.
- Yıkanmış R2R2 peletini tam bir RPMI ortamı kullanarak %1,25 v/v'ye sulandırın.
not: Fazla opsonize R2R2, Alsever'in solüsyonunda 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
4. Fc Reseptörü aracılı Fagositoz
- İlacı veya orta süpernatanı 8 odacıklı slayttan aspire edin ve% 1.25 v / v R2 R2karışımından 400 μL ekleyin. 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
- 2 saatlik inkübasyondan sonra, üreticinin adaptörlerini kullanarak hazneleri çıkarın. Fazla R2 R 2'yibir kağıt havluya kurulayın. Sürgünün kurumadığından emin olun.
- 100 mL'lik bir kabı PBS ile doldurun. Fagosite edilmemiş R2R2'nin çoğunu çıkarmak için sürgüyü yavaşça ileri geri hareket ettirerek (yaklaşık 30-40 vuruş) sürgüyü suya batırın ve yıkayın.
- Slaydı PBS'den çıkarın. Bir kağıt havlu veya kağıt mendil kullanarak fazla PBS'yi silin ve slaytı havayla kurutun.
- Havayla kurutulmuş sürgüyü 45 saniye boyunca %100 metanolde sabitleyin. Ardından, sabit sürgüyü havayla kurutun.
not: Slaytlar, Grünwald-Giemsa boyası21 veya Wright-Giemsa boyası gibi aşağı akış boyama ile daha uyumlu olan başka bir yöntem kullanılarak sabitlenebilir.
- Sürgüyü şirket içi bir Elvanol montaj ortamı (veya piyasada bulunan başka bir montaj ortamı) kullanarak monte edin ve lameller ekleyin.
not: Elvanol montaj ortamı, PBS'de %15 w/v polivinil alkol reçinesi ve %30 v/v gliserinden oluşur. Karışım, tüm reçine eriyene ve gliserin homojen bir şekilde karışana kadar ısıtılır. Bu, piyasada bulunan diğer montaj ortamlarıyla değiştirilebilir.
- Nicelemeden önce montajın gece boyunca kurumasını bekleyin.
5. Fagositozun Miktar Tayini
- Bir faz kontrast mikroskobu ve bir 40X objektif lens kullanarak, en az 200 monosit ve bu monositler içindeki fagositozluR2R2 sayısını sayarak fagositik olayların miktarını manuel olarak ölçün. Monosit sayısını ve fagositozlu R2R2 sayısını aynı anda ölçmek için her elinizde bir sayaç bulundurun.
- Fagosite edilmişR2 R2sayısını monosit sayısına bölerek ve 100 ile çarparak ortalama fagositik indeksi elde edin. Verileri ortalama (ortalama fagositik indeks) ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak ifade edin.
