1. Gerekli Reaktifleri ve Malzemeleri Hazırlayın
- % 2 fetal sığır serumu (FBS) ("yıkama tamponu") içeren fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. PBS'yi %0,1 noniyonik deterjan içeren %2 fetal buzağı serumu (FCS) ile hazırlayın ("perma yıkama tamponu"; Malzeme Tablosuna bakınız). PBS'yi %1,5 formaldehit.
ile hazırlayın
not: Formaldehit aşındırıcıdır ve potansiyel olarak kanserojendir ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyilirken kullanılmalıdır.
- Manyetik hücre ayrımı ("MCS tamponu") için %2 FBS ve 0,5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren PBS'yi hazırlayın.
- Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 50 μg / mL falloidin-floresein izotiyosiyanat (Phalloidin-FITC) hazırlayın. DMSO'da 1 mg / mL'lik bir nükleer boya (ör. DMSO'da 1 mg / mL 7-amino aktinomisin D (7-AAD) veya bis-benzimid boyası; Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. İlgilenilen hücreler ve görüntüleme akış sitometresi için uygun florokrom etiketli antikorlar hazırlayın.
- T hücrelerinin kaynağı olarak hayvan dokularını (örneğin lenf düğümleri ve dalak) ve antijen sunan hücrelerin veya progenitörlerin kaynağı olarak allojenik hayvan dokularını (örneğin dalak ve kemik iliği) elde edin.
- Hücre kültürü ortamı (örneğin, Roswell Park Memorial Institute ortamı (RPMI) 1640 veya Dulbecco'nun %10 FBS ile desteklenmiş Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)), 50 μM 2-merkaptoetanol, penisilin ve streptomisin hazırlayın ve 24 ve/veya 96 oyuklu hücre kültürü plakaları elde edin.
2. Antijen Sunan Hücreleri (APC'ler) Hazırlayın
NOT: Teorik olarak, herhangi bir APC popülasyonu bu yöntemle incelenebilir. Bu davada APC'ler olarak olgunlaşmamış fare kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelere (DC'ler) dava açıldı. Bu hücreleri oluşturmak için birçok protokol mevcuttur. Kısaca aşağıdaki protokol kullanılmıştır.
- Femur ve tibialardan iliği RPMI 1640 veya DMEM'e akıtın.
- Küçük kemik parçalarını ve kalıntıları temizlemek için asılı hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
- Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve ardından kırmızı hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir amonyum klorür tamponu kullanarak parçalayın.
- Hücreleri santrifüjleme (400 x g, 5 dakika) ile pelet yapın ve hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Hücreleri 5 - 10 mL yıkama tamponunda yıkayın, santrifüjleme ile pelet (400 x g, 5 dakika) ve hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Hücreleri biyotinile anti-CD3 (5 μg/mL), anti-B220 (5 μg/mL), anti-MHC sınıf II (1 μg/mL) ve anti-CD11b (5 μg/mL) antikorlarla etiketleyerek bir hücre ayırma sütunu üzerinde hematopoietik öncüleri zenginleştirin.
- Hücreleri santrifüjleme (400 x g, 5 dakika) ile pelet haline getirin ve hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Hücreleri anti-biyotin manyetik mikro boncuklarla (Malzeme Tablosuna bakınız) 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Hücreleri yıkayın ve peletleyin (400 x g, 5 dakika) ve 3 mL MCS tamponu ile astarlanmış ve mıknatısına yerleştirilmiş büyük bir pozitif seçim (LS) manyetik hücre ayırma sütunu kullanarak etiketli hücreleri çıkarmadan önce 1 mL MCS tamponunda yeniden süspanse edin. Kolonu 3 mL MCS tamponu ile 3 kez yıkayın; Akış, istenen hücreleri içerecektir.
- 2 ng / mL rekombinant fare granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve 2 ng / mL rekombinant insan dönüştürücü büyüme faktörü β1 (TGFβ1) ile desteklenmiş RPMI 1640 veya DMEM'de 6 gün boyunca kolondan geçen hücreleri kültürleyin. Ortamın yarısını her 2 günde bir 2 ng / mL GM-CSF ve TGFβ1 içeren yeni bir tam ortamla değiştirin.
NOT: İnsan TGFβ1, fare hücrelerinde aktiviteye sahiptir. Veriler, bu olgunlaşmamış DC'ler kullanılarak oluşturulmuştur. Diğer hücreler (örneğin, B hücreleri ve olgun DC'ler) APC'ler olarak uygun olabilir, ancak bu testte test edilmemiştir.
- DC'leri %90 serum /%10 DMSO'da kriyoprezervasyon yapın ve sıvı nitrojen içinde saklayın; kullanım gününde iyileşin. Kullanmadan önce, tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hemositometredeki canlı DC'lerin sayısını sayın. Bölüm 4'te kullanmadan önce hücre peletini uygun yoğunlukta kültür ortamında (bkz. adım 4.1) yeniden süspanse edin.
3. T Hücrelerini Hazırlayın
- Hücrelere yanlışlıkla aktive edici veya inhibe edici sinyallerin iletilmesini önlemek için negatif seçim yöntemlerini kullanın.
NOT: Bu örnekte, CD4 + T hücreleri analiz için hazırlanmıştır.
- Fare dalağından CD4 + T hücreleri hazırlamak için, dalağı bir şırınganın pistonunu kullanarak 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücre süzgecini yıkama tamponu ile yıkayın.
- Askıya alınmış hücreleri santrifüjleme (400 x g, 5 dakika) ile pelet haline getirin ve ardından peleti oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir amonyum klorür tamponunda yeniden süspanse ederek kırmızı hücreleri parçalayın.
- Hücreleri santrifüjleme (400 x g, 5 dakika) ile pelet haline getirin ve peleti yeniden süspanse edin.
- Hücreleri 5-10 mL yıkama tamponunda yıkayın ve santrifüjleme ile pelet (400 x g, 5 dakika). Peleti yeniden askıya alın.
- Hücreleri CD8, majör histouyumluluk kompleksi sınıf II (MHC II, 1 μg/mL) ve CD19'a (5 μg/mL) karşı biyotinile antikorlarla boyayın. 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 10 mL yıkama tamponunda yıkayın ve santrifüjleme ile pelet (400 x g, 5 dakika). Peleti yeniden askıya alın.
- Hücreleri, üreticinin talimatlarına göre anti-biyotin manyetik mikro boncuklarla (Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin.
- Hücreleri 10 mL yıkama tamponunda yıkayın ve santrifüjleme ile pelet (400 x g, 5 dakika); peleti tekrar askıya alın.
- Hücreleri 1 mL MCS tamponunda yeniden süspanse edin ve CD4 + T hücrelerini, bir mıknatıs üzerinde 3 mL MCS tamponu ile astarlanmış bir manyetik hücre ayırma sütunu üzerinde zenginleştirin. Kolonu 3 mL MCS tamponu ile 3 kez yıkayın. Sütun akışı, zenginleştirilmiş T hücrelerini içerecektir.
- Standart akış sitometrisi ile, negatif olarak seçilmiş hücrelerin bir alikotunu kullanarak T hücresi saflığını değerlendirin. Hücreleri bir florokrom-streptavidin konjugatı (kolon üzerinde çıkarılması gereken herhangi bir biyotin etiketli hücreyi tanımlamak için) ve ilgilenilen T hücresi popülasyonunu tanımlamak için bir antikor veya antikorlar (bu durumda CD4) kullanarak boyayın; % ≥85'lik bir saflık kabul edilebilir.
- Bir hemositometredeki T hücrelerini tripan mavisi dışlaması ile sayın (% ≥90 canlılık kabul edilebilir).
NOT: MCS tamponu, testten önce çıkarılması gereken EDTA içerir. Bunu başarmak için, hücreleri santrifüjleme (400 x g, 5 dakika) ile peletleyin ve 1 mL yıkama tamponunda yıkayın. Hücreleri tekrar peletleyin (400 x g, 5 dk) ve uygun yoğunlukta kültür ortamında yeniden süspanse edin (bkz. adım 4.1).
4. T Hücrelerini ve DC'leri birlikte inkübe edin
- 24 oyuklu veya 96 oyuklu hücre kültürü plakasında 2:1 T: DC oranında tohum T hücreleri ve DC'ler. Nihai kültür hacminin 24 oyuklu plakalar için ≤500 μL veya 96 oyuklu plakalar için ≤50 μL olduğundan emin olun.
NOT: Daha küçük hacimler hücre-hücre etkileşimlerini teşvik eder ve sonraki fiksasyon tamponları için alan sağlar.
- Kesin hücre sayılarını ampirik olarak ayarlayın, ancak genel bir kılavuz olarak, oyuk başına 1 x 106 T hücre ve 0,5 x 106 DC kullanın (96 oyuklu plaka). Bunlar minimum hücre sayıları olarak düşünülmelidir, çünkü daha az hücre kullanmak bağışıklık sinapslarının sayımını zorlaştırır.
- Hücre sayılarını artırmak için, 5. adımdan (fiksasyon) sonra çoğaltma kuyuları ve havuzu kurun.
NOT: Replike kuyuları kurarken, önce tüm kuyucuklarda DC'lerin tohumlanması ve ardından tüm kuyucuklarda T hücrelerinin tohumlanması tavsiye edilir; Bu, kuyular arasındaki inkübasyon süresindeki tutarsızlıkları en aza indirir.
- Plakayı %5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 4 saat inkübe edin.
5. Hücreleri Plakaya Sabitleyin
- Her bir oyuka PBS'deki% 1.5 formaldehitin kültür hacminin 3 katını ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin; Hücre-hücre etkileşimlerinin bozulmasını en aza indirmek için hücreleri plakadan çıkarmadan önce sabitlemek önemlidir.
- Plakadaki hücreleri, daha sonra yıkama ve boyama için tüplere aktarın. Bu aşamada, tek leke kontrolleri için ek hücreler ayırın. Bu kontrollerden ayrı olarak, tüm kültür antikor kokteyli ile boyanmalıdır (bkz. adım 4.1.1).
6. Leke Hücreleri
- İstenen florokrom konjuge antikorların bir kokteylini içeren 100 μL'lik yıkama tamponundaki hücreleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca, ışıktan korunarak boyayın.
NOT: Kokteyl, T hücresine özgü ve APC'ye özgü antikorlar içerir. Florokromlar, görüntüleme akış sitometresinin konfigürasyonu kullanılarak ayırt edilebilecek şekilde seçilmelidir. Burada gösterilen deneylerde, mavi floroforla konjuge CD11b (5 μg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ve APC-konjuge CD90.2 (5 μg/mL) kullanılmıştır.
- Hücreleri 1 mL yıkama tamponunda yıkayın ve 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Hücreleri 0.05-0.5 μg / mL'de falloidin FITC içeren perma yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
NOT: Yaklaşık 0.1 μg/mL'lik falloidin FITC konsantrasyonları fare hücreleri için iyi çalışır, ancak uygun konsantrasyonun tedarikçiye, hücre tipine ve görüntüleme akış sitometresine göre değişmesi beklenir.
- Hücreleri 1 mL perma / yıkama tamponunda yıkayın ve 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın. Hücreleri uygun konsantrasyonda (örneğin, yaklaşık 25 μg / mL 7-AAD) nükleer boya içeren perma / yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 1 mL perma / yıkama tamponunda yıkayın ve 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın. Hücreleri bir kez yıkama tamponunda, pelette yıkayın ve 50 - 100 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin, hücreleri küçük, kapaklı mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
- Hemen veri toplamaya devam edin veya hücreleri, görüntüleme akış sitometresinde alımdan önce birkaç güne kadar ışıktan koruyarak 4 °C'de saklayın.
NOT: Hücreler bu şekilde 7 güne kadar başarıyla saklanmıştır. Daha uzun depolama mümkün olabilir, ancak test edilmemiştir.
7. Veri Al
- Görüntüleme akış sitometresini üreticinin talimatlarına göre başlatın ve yapılandırın. Herhangi bir veri toplamadan önce akış çekirdeğinin kararlılığını sağlayın.
- Parlak alan görüntüsü almak için bir kanal ayırın. Parlak alan kanalı kapalıyken tek leke kontrol verilerini alın.
- "Yükle" düğmesine tıklayın ve tamamen lekeli bir numune (gerekli tüm florokromlarla boyanmış bir numune) içeren bir tüpü tutucuya yerleştirin.
- "Çalışma alanı" penceresinde, en boy oranının 1'e yakın olduğu alan ve geçit tekilleri üzerinde en boy oranıyla yeni bir dağılım grafiği seçin ve oluşturun. Kullanılan her kanal için yeni bir dağılım grafiği oluşturun (yatay eksendeki kanalın yoğunluğu).
- Her florokrom için pozitif popülasyonu kontrol edin ve gerekirse "Aydınlatma" kutusundaki lazer voltajını ayarlayın.
- Tüpü boşaltın ve ilk tek lekeli tüpü yükleyin.
- "Edinme Ayarları" kutusuna, örnek adını yazın ve toplanması gereken olay sayısını ayarlayın; tek bir leke ise (telafi kontrolleri için), 1.000 - 2.000 olay yeterlidir.
- "Kanallar" kutusunda, her bir örneğin lekelendiği kanalları seçin. Tek leke kontrolleri için, tüm kanallar parlak alan ve yan saçılma kapalı olarak seçilmelidir. "Edinme" kutusunun altındaki "Kaydet" düğmesini tıklayın; Olay sayısı belirtilen eşiğe ulaştığında, alım otomatik olarak durdurulur.
- Tüpü boşaltmak için "Geri Dön" düğmesine tıklayın. Her tek leke kontrolü için 7.2.4 - 7.2.6 adımlarını tekrarlayın. Sitometre ve yazılıma bağlı olarak, edinim sırasında Şekil 1'de gösterilen tüm kapıları ayarlamak mümkün olmayabilir (analiz sırasında daha hassas geçit yapılır; bkz. bölüm 8).
- Tek lekeli örneklerde olduğu gibi örnekleri alın (adım 7.2'de), ancak "Kanallar" kutusunda, parlak alan kanalı da dahil olmak üzere gerekli olan tüm kanalları seçin.
- Verileri kaydetmeden önce, kanal yoğunluğunun istenen hücre popülasyonlarını tanımlamak için uygun olduğunu doğrulamak için kontrol edin. Değilse, lazer ayarlarını yapın ve adım 7.2'de açıklandığı gibi yeni ayarları kullanarak tek leke kontrollerini yeniden kaydedin.
- Her örnek için on binlerce olay elde edin.
not: Çoğu koşulda, hücre-hücre temas olayları, toplam hücre sayısının küçük bir azınlığıdır (çoğu tek hücrelidir). Genel olarak, son membran temas kapısında en az 100 olayın olması arzu edilir.
