Bronkoalveoler Lavaj Sıvısındaki İmmün Hücrelerin Flow Sitometri ile Tanımlanması ve Sayımı

Özet

Kaynak: Van Hoecke, L. ve ark., İnflamatuar Hücre İnfiltrasyonunu Analiz Etmek İçin Murin Akciğerlerinin Bronkoalveolar Lavajı.J. Vis. Uzm.(2017)

Bu video, bronkoalveoler lavaj sıvısındaki çeşitli bağışıklık hücrelerini tanımlamak ve saymak için akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir. Başlangıçta, tek bağışıklık hücreleri bir canlılık boyası kullanılarak tanımlanır, ardından yüzey işaretleyici proteinlerin diferansiyel boyanması ile her hücre tipinin kesin sayımı sağlanır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Hazırlık

1. Lavaj sıvısı
   1. 100 μM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile dengeli bir tuz çözeltisi hazırlayın.
      not: Bronkoalveoler Lavaj (BAL) sıvısındaki protein seviyelerini ölçmek için, BAL sıvısındaki proteaz aktivitesini önlemek için proteaz inhibitörlerinin eklenmesi önerilir.
2. sonda
   1. Şeffaf plastik polietilen 21 G boruya (iç çap: 0,58 mm, dış çap: 0,965 mm ve uzunluk: 0,5 cm) 23 G iğne sokarak bir kateter yapın. Hazır kateterler de kullanılabilir.
3. Anestezik
   1. Tercihen solunum durmasına neden olan bir terminal anestezik hazırlayın (ör., fosfat tamponlu salin (PBS) içinde sodyum pentobarbital (>100 mg / kg) çözeltisi gibi bir barbitürat).
      not: İnhale anestezi BAL sıvı içeriğini etkileyebileceğinden, inhale anestezi yerine enjekte edilen anestezinin kullanılması önerilir. Örneğin CO₂, kanın pH'ı ve sonuç olarak farklı bileşiklerin yeniden dağılımı üzerinde bir etkiye sahiptir.
4. Amonyum-klorür-potasyum (ACK) kırmızı kan hücresi lizis tamponu
   1. 8.29 g amonyum-klorür (_NH4Cl) ve 1 g Potasyum bikarbonatı (KHCO₃) 1 L H₂O'da 100 μM EDTA ile çözerek bir ACK lizis tamponu hazırlayın; Kırmızı kan hücresi lizis tamponu da harici bir kaynaktan satın alınabilir.

2. Bronkoalveoler Lavajın (BAL) Yapılması

1. Kateterin trakeaya sokulması
   1. 26 G'lik bir iğne kullanarak kısa etkili bir barbitürat anestezikinin öldürücü bir dozunun intraperitoneal enjeksiyonu ile fareyi ötenazi yapın. Uygun ölümcül anesteziyi doğrulamak için, ayak refleksini kontrol etmek için farenin arka pençesini forseps ile sıkıştırın.
   2. Hayvanı cerrahi bir plakaya sırt üstü yatırın ve uzuvları sabitleyerek fareyi sabitleyin.
   3. Dezenfekte etmek için boynuna% 70 etanol püskürtün. Bir neşter kullanarak trakea yakınındaki boyun derisinde bir kesi yapın.
   4. Tükürük bezlerini ortaya çıkarmak için cildi açın. Sternohyoid kasını açığa çıkarmak için kıskaç kullanarak tükürük bezlerini ayırın. Trakeayı ortaya çıkarmak için kerpeten kullanarak trakea etrafındaki kasları kesin.
   5. Kerpeten kullanarak trakeanın altına bir pamuk ipliği yerleştirin.
   6. Açıkta kalan trakeanın ortasını iki kıkırdak halkası arasında 26 G'lik bir iğne ile dikkatlice delin. Soluk borusuna daha fazla zarar vermemeye dikkat edin.
   7. Kateteri trakeaya yaklaşık 0,5 cm yerleştirin. Akciğer yapısına zarar verebileceğinden, kateterin trakeaya çok fazla yerleştirilmediğinden emin olun.
   8. Adım 2.1.5'te yerleştirilen pamuk ipliğini kullanarak trakeayı kateterin etrafına bağlayarak kateteri stabilize edin. Kateter yeterince bağlanmazsa, enjekte edilen dengeli tuz çözeltisi akciğerlere inmek yerine solunum yolunun üst kısmına doğru akabilir.
2. Lavaj sıvısını toplayın
   1. 100 μM EDTA ile 1 mL steril dengeli tuz çözeltisi ile 1 mL'lik bir şırınga yükleyin.
   2. 1 mL şırıngayı katetere bağlayın ve tuz / EDTA çözeltisini akciğere nazikçe enjekte edin.
   3. Farenin göğüs kafesine masaj yaparken solüsyonu nazikçe aspire edin. Aspirat sıvısı şırıngada görünmüyorsa, kateteri trakeanın biraz daha altına veya yukarısına dikkatlice yerleştirin.
   4. Şırıngayı iğneden çıkarın ve geri kazanılan lavaj sıvısını buz üzerine yerleştirilmiş 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Normalde, 1 mL enjekte edilen çözeltiden 700 - 900 μL BAL geri kazanılır.
   5. 2.2.1 - 2.2.4 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
      not: Amaç hücresel olmayan içeriği analiz etmekse, hassasiyet sorunları olduğunda havuzlanan numunelerin konsantre edilmesi önerilir.

3. BAL Sıvısının Hücresel ve Hücresel Olmayan Bileşenlerinin Toplanması

1. Lavaj sıvısını 400 x g ve 4 °C'de 7 dakika santrifüjleyin.
2. Süpernatanı toplayın ve hemen daha fazla analiz için kullanın (örneğin, enzime bağlı immünosorbent testi, ELISA) veya -80 ° C'de dondurun. Akciğerlerdeki hücresel akışı analiz etmek için hücre peletini saklayın.
3. Hücre peletini 200 μL ACK parçalama tamponunda yeniden süspanse edin.
   not: Bu adım, beyaz kan hücrelerini sağlam tutarken eritrositlerin parçalanmasını sağlar.
4. RT'de 2 dakika inkübe edin.
   not: Kırmızı hücre lizizinin neden olduğu varyasyonu azaltmak için bu adım 2 dakikadan daha uzun süre gerçekleştirilmemelidir.
5. ACK lizasyon tamponunu seyreltmek için 1 mL soğuk PBS ekleyin.
6. 400 x g ve 4 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri aşağı akış analizi için yeterli miktarda PBS'de yeniden askıya alın (aşağıya bakın).
   not: PBS'nin hacmi, gerçekleştirilecek olan aşağı akış çalışmasına bağlıdır.

>4. BAL Sıvısındaki Farklı Hücre Tiplerinin Akış Sitometrisi ile Analizi

NOT: Bir olasılık, akış sitometrisi yaparak BAL sıvısının mutlak ve bağıl hücresel bileşimini analiz etmektir. Bu yazının amacı BAL tekniğini detaylandırmaktır. Flow sitometri kendi başına özel bir tekniktir. Akış sitometrisi tekniği ile ilgili özel makalelerin okunması önerilir. Belirli bir hücre tipine (hücrelerine) özgü yüzey antijenlerini tanıyan bir florofora bağlı antikorlar (bakınız Tablo 1) kullanılır. Bir geçit stratejisi kullanarak, BAL'ın hücre fraksiyonundaki T hücrelerini, makrofajları, dendritik hücreleri, B hücrelerini, eozinofilleri ve nötrofilleri tanımlamak mümkündür.

1. Hücre yüzeyi boyama
   not: Akış sitometrisi analizi için tüm kritik kontrolleri dahil etmek önemlidir. Üç set tüpe ihtiyaç vardır (bakınız Tablo 2): (1) numuneleri içeren tüpler; (2) tek lekeler yapmak için her antikor-florofor için BAL hücreli tüpler; Bu, akış sitometresindeki her kanal için voltajların belirlenmesine izin verir; ve (3) tek lekeler yapmak için her antikor-florofor için boncuklu tüpler; Bu, kompanzasyon matrisini belirlemek içindir.
   1. Uygun dilüsyonlarda PBS'de antikorların ve Fc-bloğunun (anti-CD16 / CD32) bir karışımını yapın (bakınız Tablo 2). Deneyden önce her bir antikor için en uygun çalışma seyreltmesini belirlemek gerekir.
   2. Örnek için 50 μL antikor karışımındaki hücreleri yeniden süspanse edin ve kritik kontrollere 50 μL uygun şekilde seyreltilmiş antikor ekleyin.
      not: Boyama, 96 oyuklu, u şeklinde bir plakada gerçekleştirilebilir. Bu, leke hacmini kolayca azaltmayı ve önemli miktarda numune çalıştırmayı mümkün kılar.
   3. Karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   4. 400 x g ve 4 °C'de 7 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
   5. PBS'deki hücreleri 200 μL.
      'lik bir nihai hacme yeniden süspanse edin not: Bu son hacim, akış sitometresinin erişebileceği minimum hacme bağlıdır. Bu, makineler arasında biraz farklılık gösterebilir. Ek olarak, okuma hacmi, hücre sayısına ve/veya numunenin akış sitometresinde çalışması için gereken süreye bağlıdır.
   6. Akış sitometrik analizi için numuneleri ve kontrolleri kullanın.
      not: Farklı hücre popülasyonlarının mutlak hücre sayısını belirlemek için, sayma boncukları eklenmelidir. Ölçümden hemen önce her numuneye aynı sayıda boncuk (± 25.000 boncuk) ekleyin. İleri ve yan saçılma kullanılarak, sayma boncukları akış sitometrisi ile tanımlanabilir (bkz. Şekil 1). Daha sonra, numunedeki mutlak hücre sayısı, boncuk olaylarının hücre olaylarına oranı karşılaştırılarak hesaplanabilir. Aşağıdaki formül kullanılabilir:
      
2. Akış sitometrik analizi
   not: Akış sitometrik analizi, boyama protokolünün tamamlanmasından hemen sonra yapılmalıdır. Sinyal tespiti için uygun lazerlere ve filtrelere sahip bir akış sitometresi kullanılmalıdır. Tablo 3, bu yazıda açıklanan çalışma için gerekli olan lazerler ve filtrelere genel bir bakış sunmaktadır. Akış sitometrik analizi hakkında daha fazla bilgi için Adan ve ark.'ya bakınız.
   1. Birincil kapıları, döküntü ve çiftler hariç, ileri ve yan saçılmaya göre ayarlayın (bkz. Şekil 1).
   2. Tek lekeli hücreler ve boncuklar yardımıyla spektral örtüşme için voltajı ve telafisini ayarlayın.
      not: Bu ayarlar her akış sitometresi için farklıdır ve her deneyden önce kontrol edilmesi gerekir. Doğru akış analizi için, ileri ve yan saçılma gerilimleri kritik öneme sahiptir. Doğru bir ileri ve yan saçılma, analiz edilen hücrelerin kimliğinin tanımlanmasına ve doğrulanmasına yardımcı olabilir. Bu voltajları belirlemek için önce lekelenmemiş bir numune çalıştırılmalıdır.
   3. Yüzey antijeni için floresan kapıları kurun (bkz. Şekil 1) ve numuneleri analiz edin.

Tablo 1: İmmün Hücre Yüzey Antijenlerinin Seçimi. Bu tablo, farklı hücre tiplerini karakterize etmek için kullanılan yüzey epitoplarının bir listesini sağlar. Belirli bir hücre tipini güvenilir bir şekilde tanımlamak için birkaç işaretleyicinin kombinasyonları gerekecektir.

edilir Serisi

Antijen	Hücre tipi
Farklılaşma kümesi 3 (CD3)	T hücrelerinde eksprese
Farklılaşma kümesi 11c (CD11c)	Çoğu dendritik hücrede, aynı zamanda monositlerde, makrofajlarda, nötrofillerde ve bazı B hücrelerinde yüksek ekspresyon.
Farklılaşma kümesi 11b (CD11b)	Monositler, nötrofiller, doğal öldürücü hücreler, granülositler ve makrofajlar dahil olmak üzere birçok lökositin yüzeyinde eksprese edilir.
SiglecF	Alveolar makrofajlar ve eozinofiller.
MHCII (MHCII)	Normalde sadece dendritik hücreler, mononükleer fagositler ve B hücreleri gibi antijen sunan hücrelerde bulunur.
CD19	B-lenfosit antijeni
Ly-6G	Monositler, granülositler ve nötrofiller için bir belirteç

Tablo 2. Dahil Edilecek Kontrollerin Listesi. Bu tablo, elde edilen sonuçların doğru yorumlanması için gerekli tüm kontrolleri göstermektedir.

) Serisi ) Serisi ) Serisi

Örnekleri
tüp	Hücrelere eklenecek antijen-florofor	Antikor stok konsantrasyonu (mg/mL)	Antikor seyreltmesi	Toplam hacim (μL)
	Sabitlenebilir canlılık boyası	0,2	1/1000	50
	CD11c (İngilizce)	0,2	1/800	50
	SiglecF	0,2	1/100	50
örnek X	MHCII (MHCII)	0,2	1/200	50
	CD3 (İngilizce	0,2	1/200	50
	CD19	0,2	1/200	50
	CD11b	0,2	1/200	50
	Ly6G (İngilizce)	0,2	1/200	50
Gerilim kontrolleri
tüp	Hücrelere eklenecek antijen-florofor	Antikor stok konsantrasyonu (mg/mL)	Antikor seyreltmesi	Toplam hacim (μL)
Lekelenmemiş hücreler	/	/	/	50
Tek lekeli hücreler	Sabitlenebilir canlılık boyası	0,2	1/1000	50
Tek lekeli hücreler	CD11c (İngilizce)	0,2	1/800	50
Tek lekeli hücreler	SiglecF	0,2	1/100	50
Tek lekeli hücreler	MHCII (MHCII)	0,2	1/200	50
Tek lekeli hücreler	CD3 (İngilizce	0,2	1/200	50
Tek lekeli hücreler	CD19	0,2	1/200	50
Tek lekeli hücreler	CD11b	0,2	1/200	50
Tek lekeli hücreler	Ly6G (İngilizce)	0,2	1/200	50
Kompanzasyon kontrolleri
tüp	Boncuklara eklenecek antijen-florofor	Antikor stok konsantrasyonu (mg/mL)	Antikor seyreltmesi	Toplam hacim (μL)
Lekesiz boncuklar	/	/	/	200
Tek lekeli boncuklar	CD11c (İngilizce)	0,2	1/2000	200
Tek lekeli boncuklar	SiglecF	0,2	1/2000	200
Tek lekeli boncuklar	MHCII (MHCII)	0,2	1/200	200
Tek lekeli boncuklar	CD3 (İngilizce	0,2	1/2000	200
Tek lekeli boncuklar	CD19	0,2	1/2000	200
Tek lekeli boncuklar	CD11b	0,2	1/400	200
Tek lekeli boncuklar	Ly6G (İngilizce)	0,2	1/200	200

Tablo 3: Bu Çalışmada Kullanılan Akış Sitometresinin Lazerlerine ve Filtrelerine Genel Bakış.

Lazer tipi	Filtre kurulumu
	505 LP	525/50
Mavi (488 nm)	550 LP	575/26
100 mW	670 LP	685/35
	750 LP	780/60
menekşe 405 nm		450/50
100 mW
Kırmızı 633 nm		660/20
70 mW	750 LP	780/60

Sonuçlar

Şekil 1: BAL sıvısındaki makrofajların, dendritik hücrelerin, T hücrelerinin, B hücrelerinin, nötrofillerin ve eozinofillerin akış sitometrik tespiti için geçit stratejisi. BAL hücreleri, tarif edilen BAL protokolü kullanılarak izole edildi. Hücreler, lipopolisakkaritin intratrakeal damlatılmasından 24 saat sonra farelerden izole edildi. Sayma boncukları ve hücreleri, ileri ve yan saçılma özelliklerin...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dengeli tuz çözeltisi	Thermo Fisher Bilimsel	14175-129
Etilendiamintetra asetik asit	Sigma-Aldrich	E6511	can sıkıcı
23G x 1 1/4 iğne	Henke Sass Kurt	4710006030	Boyut: 0,60 x 30 mm
26G x 1/2 neelde	Henke Sass Kurt	4710004512	Boyutu: 0,45*12 mm
Plastik boru	BD tıbbi teknolojisi	427411	Polietilen Boru, İç Çap 0,58 mm (.023 ") Dış Çap . 965 mm (0,38 inç) 30,5 m (100 inç)
Sodyum pentobarbital	Kela NV	514
Fosfat tamponlu salin	Fransa	BE17-516F	Ca++, Mg++ veya fenol kırmızısı içermeyen PBS; steril filtreli
1 ml şırınga	Henke Sass Kurt	5010.200V0	Pirojenik olmayan ve toksik olmayan
Forseps	Güzel Bilim Araçları GmbH	91197-00
Cerrahi makas	Güzel Bilim Araçları GmbH	91460-11
Santrifüj tüpü 50 ml	lik. Geyer (Türkçe)	7696705	Rnase/Dnase/endotoksin içermez
Santrifüj tüpü 15 ml	lik. Geyer (Türkçe)	7696702	Rnase/Dnase/endotoksin içermez
Mikrosantrifüj tüpü 1,5 ml	Sigma-Aldrich	0030 120.094	Polipropilen
Mikrosantrifüj	Sigma-Aldrich	5415R
merkezkaç	Thermo Fisher Bilimsel	75004030
Amonyum-klorür-potasyum (ACK) parçalama tamponu	Fransa	10-548E	Steril filtreli
Canlı/ölü -efluor506	ebiyobilim	65-0866-18	Sabitlenebilir canlılık boyası
CD11c-PE-cy7	eBiosciences (Biyoloji Bilimleri)	25-0114-81
SiglecF-PE	BD Pharmingen	552126
MHCII-APCefluor780	Biyoefsane	107628
CD3-PE-cy5	VWR (VWR)	55-0031-U100
CD19-PE-cy5	eBiosciences (Biyoloji Bilimleri)	15-0193-83
CD11b-V450	BD Pharmingen	560455
Ly6G-AF700	Biyoefsane	127621
Mutlak Sayma Boncukları	Yaşam Teknolojileri Avrupa B.V.	C36950
anti-CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
96 kuyucuklu 340 μL saklama plakası	doğan	353263	V altlı, doğal polipropilen
Akış sitometresi	BD Biyolojik Bilimler
sonda	BD Biyolojik Bilimler	393202

Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Serisi