1. Replikasyon Yapan ve Replikasyon Yapmayan MIC90 Tahlillerinin Ayarlanması
- M. tuberculosis, M. bovis BCG veya M. smegmatis'i 0.01-0.1'lik bir OD580'de aşılayın ve Middlebrook 7H9-ADN'de (Middlebrook 7H9 %0.2 gliserol, %0.2 dekstroz, %0.5 albümin ve %0.085 NaCl içerir) veya 7H9-OADC'de (Middlebrook 7H9 %0.2 gliserol ve %10 OADC takviyesi içerir) orta log fazına (OD580 ~ 0.5) genişletin.
- M. tuberculosis ve M. bovis BCG'yi hücre kültürü şişelerinde ~20 ml ayakta kültür olarak ve M. smegmatis'i polipropilen yuvarlak tabanlı (4 ml kültür) veya 50 ml konik santrifüj tüplerinde (10-20 ml kültür) çalkalanarak büyütün. Patojenik mikobakterileri 37 ° C'de% 20O2 ve% 5 CO2 ile ve M. smegmatis'i 37 ° C'de% 20O2 ile inkübe edin.
- Tekrarlayan ve tekrarlamayan koşullar altında minimal inhibitör konsantrasyon (MIC90) tarzı bir deney kurun (Şekil 1).
not: Test ajanları genellikle, 96 oyuklu mikroplaka başına sırasıyla 4 veya 2 bileşiğin test edilmesine izin vermek için iki veya dört kopya halinde test edilir. Örneğin, 96 oyuklu bir plakada, bir test ajanı A-D satırlarında ve diğeri E-H satırlarında test edilebilir. DMSO (araç) sütun 1, 2 ve 12'dedir ve test ajanı seyreltme serisi sütun 3'ten (en düşük konsantrasyon) sütun 11'e (en yüksek konsantrasyon) kadar uzanır. MIC90 tarzı tahliller tipik olarak 2 katlı bir seyreltme serisi kullanır. Mikobakteriler için çok sayıda replike olmayan model mevcuttur ve açıklama amacıyla, çok stresli bir replikasyon olmayan model kullanıyoruz.
- Çoğaltma tahlili için, 7H9-ADN'de 200 μl hücreleri 0.01'lik bir OD580'de şeffaf tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakanın tüm oyuklarına dağıtın.
- Replike olmayan tahlil için,% 0.02 tyloxapol içeren fosfat tamponlu salin (PBS) içinde hücreleri iki kez yıkayın ve hücreleri replike olmayan ortamda (% 0.05 KH2PO4,% 0.05 MgSO4,% 0.005 ferrik amonyum sitrat,% 0.0001 ZnCl2,% 0.1 NH4Cl,% 0.5 BSA,% 0.085 NaCl,% 0.02 tyloxapol,% 0.05 bütirat; pH, 2 N NaOH ile 5.0'a ayarlanmıştır).
- Hücreleri replike olmayan bir ortamda 0.1'lik bir OD580'e seyreltin ve yeni hazırlanmış 1 M'lik bir stoktan 0.5 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar NaNO2 ekleyin.
- 0.1'lik bir OD580'de 200 μl hücreleri, açık tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakanın tüm kuyucuklarına dağıtın.
not: Bileşik seyreltmeleri DMSO'da 100 kat stok çözeltileri olarak hazırlayın. Bu nedenle, bir molekülün etkisini 0.4-100 μg / ml'lik bir nihai konsantrasyonda test eden tipik bir MIC plakası, DMSO'da 0.04-10 mg / ml'lik stok çözeltileri gerektirecektir.
- A-E satırlarına 2 μl test ajanı 1 dilüsyonunu ve E-H satırlarına 2 μl test ajanı dilüsyonunu ekleyin. İyice karıştırın.
- Kontrol kuyularına, sütun 1, 2, 12'ye (AH sıraları) 2 μl araç kontrolü (genellikle DMSO) ekleyin. İyice karıştırın.
- Her deney için, 0.004 ila 1 μg / ml (tekrarlayan test) ve / veya 0.08 ila 20 μg / ml (replike etmeyen test) rifampisin gibi en az bir pozitif kontrol ekleyin.
not: 0.1 ila 25 μg / ml'de 6-bromo-1H-indazol-3-amin9 kullanımı, çoklu stresli replikasyon modelinde seçici, NaNO2'ye bağlı aktiviteye sahip bir kontrol bileşiği olarak önerilir.
- Tahlilleri tekrarlamak için, mikroplakaları 37 ° C'de% 20O2 ve% 5 CO2'de 7 gün (M. tuberculosis ve M. bovis BCG) veya 1-48 saat (M. smegmatis) inkübe edin. Replikasyonun çok stresli modeli için, mikroplakaları 37 ° C'de% 1O2 ve% 5 CO2'de (M. tuberculosis ve M. bovis BCG) 7 gün boyunca inkübe edin.
2. CARA Mikroplakalarının Aşılanması
- CARA'nın bir okuma olarak kullanılacağı zaman noktalarında, 50-75 μl'de ayarlanmış bir p200 çok kanallı pipet kullanarak MIC90 tarzı tahlil plakasının kuyu içeriğini dikkatlice yeniden süspanse edin. En az 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve pipet uçlarını kullanarak kuyu içeriğini dairesel hareketlerle hafifçe döndürün.
- 10 μl tahlil kuyusu içeriğini CARA mikroplakasına aktarın. Tahlil plakasındaki kuyu içeriğinin sırasının, CARA mikroplakasının kuyu içeriğinin sırasıyla eşleştiğinden emin olun. Transferler sırasında sıçramasını önleyin ve 10 μl'nin CARA mikroplaka kuyularının ortasına yerleştiğinden emin olun. 10 μl'nin CARA mikroplakasına emildiğini onaylayın.
not: CARA mikroplakalarında hücreleri tespit etmeden önce herhangi bir seyreltme gerekli değildir.
- CARA mikroplaka yığınlarını plaka bantla bağlayın ve ardından yeniden kapatılabilir bir plastik torbaya koyun. CARA mikroplakalarını 37 °C'de %20O2 (M. smegmatis) veya %1O2 ve %5 CO2 (M. tuberculosis ve M. bovis BCG) ile inkübe edin.
- M. tuberculosis ve M. bovis BCG için, tekrarlayan tahliller: 7 gün inkübe edin; M. tuberculosis ve M. bovis BCG replike olmayan tahliller için 10 gün inkübe edin; M. smegmatis için, tekrarlayan tahliller, 1-2 gün inkübe edin; M. smegmatis için, replike etmeyen tahliller, 2-3 gün inkübe edin.
NOT: Süreler tahminidir ve farklı yineleme, yinelenmeyen ve stres koşulları için uygun şekilde değiştirilebilir.
3. CARA Mikroplakalarının Geliştirilmesi
- Negatif (araç) kontrol kuyularında bir bakteri üremesi filmi veya daha büyük, makroskopik koloniler görüldüğünde CARA mikroplakalarını geliştirin.
not: Uzun süreli inkübasyondan sonra, CARA mikroplaka kuyucukları genellikle kuru görünür ve kuyu içeriğinin steril PBS ile önceden ıslatılmasını öneririz. Bu, kömürün resazurini emmesini önlemeye hizmet eder, bu da düşük floresan veya kuyudan kuyuya varyasyona yol açabilir.
- Çok kanallı bir pipet ile tek bir 12 p200 uç seti kullanarak, kuyucukların kenarı boyunca 40 μl steril PBS dağıtın ve PBS'nin agar / bakteri mikrokolonilerinin üstüne dağılmasına izin verin.
- PBS'de 5 mg resazurin (% 0.01 final) ve 50 ml% 5 Tween-80'i karıştırarak CARA geliştirme reaktifi hazırlayın. Vorteks ve steril filtre.
not: Alternatif bir CARA geliştirme reaktifi, ticari olarak hazırlanmış resazurin sıvı çözeltisinin PBS'de %10 Tween80 ile 1: 1 (hacim / hacim) oranında karıştırılmasıyla hazırlanabilir.
- 12 kanallı bir pipet kullanarak CARA mikroplakasının her bir oyuğuna 50 μl taze hazırlanmış CARA geliştirme reaktifi ekleyin. Reaktifleri her bir oyuktaki agar ve bakteri matı boyunca dağıtmaya yardımcı olmak için plakaları birkaç kez ileri geri sallayın.
- Plakaları tekrar kapatılabilir bir plastik torbaya koyun ve 37 ° C'de M. smegmatis için en az 30 dakika ve M. tuberculosis veya M. bovis için 45-60 dakika inkübe edin BCG.
not: Araç kontrol kuyuları ilk bir saat içinde pembeye dönmezse, plakalar yeniden torbalanabilir ve daha uzun süre inkübe edilebilir.
- Floresan okumadan önce, CARA mikroplakalarını, kapakları çıkarılmış olarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir biyogüvenlik başlığına yerleştirin. BSL3 spektrofotometrelerini bir biyogüvenlik kabininin dışında kullanırken, plakanın üzerine optik kalitede bir PCR etiketi yapıştırın ve yumuşak bir kağıt havluyla çıkartma yüzeyine hafifçe bastırarak sıkıca kapatın.
- 530 nm'de uyarma ve 590 nm'de emisyon ile üstten okuma yoluyla floresansı belirleyin. Plakayı boşaltmak gerekli değildir.
