1. Ortam ve Reaktif Hazırlama
- Fibroblast besiyeri hazırlayın. 450 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamını (DMEM), 50 mL fetal sığır serumunu (FBS) ve 5 mL penisilin / streptomisin'i birleştirin. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
- Raportör makrofaj büyüme ortamını 50 mL alikotlarda hazırlayın. 45 mL DMEM, 5 mL FBS, 5 μg/mL mikoplazma eliminasyon reaktifi (Malzeme Tablosu) ve 200 μg/mL fleomisin D1'i (Malzeme Tablosu) birleştirin. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
- Muhabir makrofaj tahlil ortamını 50 mL'lik alikotlarda hazırlayın. 45 mL DMEM, 5 mL ısıyla inaktive edilmiş FBS (HI-FBS), 5 μg/mL mikoplazma eliminasyon reaktifi ve 200 μg/mL fleomisin D1'i birleştirin. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
2. Hücre Kültürü Yüzeylerinin Poli(metil metakrilat) ile Kaplanması
- Poli (metil metakrilat) (PMMA) kloroformda 20 mg / mL'de (ör., 5 mL kloroformda 100 mg PMMA) 20 mL'lik bir cam sintilasyon şişesinde çözün. Şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve tüm katılar çözülene kadar en az 2 saat karıştırmaya bırakın.
Dikkat: Kloroform solunması halinde zararlıdır. PVA eldivenleri giyerken çeker ocakta solvent kullandığınızdan emin olun.
- 400 μL PMMA solüsyonunu bir borosilikat cam mikroskop slaytının merkezine bir spin kaplayıcı içinde pipetleyin ve 2 dakika boyunca 3000 rpm'de döndürün. Test için gerekli slayt sayısını ve su temas açısı ölçümü için fazladan 3-5 slayt hazırlayın. Slaytları ileride kullanmak üzere temiz bir kutuda (püskürtülmüş ve %70 etanol ile silinmiş) saklayın.
not: Spin kaplama genellikle düz bir yüzey üzerinde ince, homojen bir kaplama biriktirmek için kullanılır. Bir spin kaplayıcı, kaplama çözeltisini yüzeye yaymak için merkezkaç kuvveti kullanarak bir alt tabakayı yüksek hızlarda döndürür.
- Cam yüzeyin tamamen polimerle kaplandığından emin olmak için bir gonyometre ile ekstra kaplanmış slaytların (yani hücre kültürü için kullanılan slaytların değil) yüzeyinde iki rastgele konumda su temas açısını ölçün.
NOT: Su temas açısı ölçümleri için yalnızca en yüksek saflıkta su (örn. cam üçlü damıtılmış) kullanılmalıdır.
- Bir biyolojik güvenlik kabininde (BSC), steril forseps kullanarak ve aseptik tekniği izleyerek 8 odacıklı yapışkan kuyuları PMMA kaplı slaytlara takın. Güçlü bir şekilde takıldıklarından emin olmak için yapışkan kuyucukların üstüne sıkıca bastırın. Sızdırmazlığı sabitlemek için slaytları takılı yapışkan kuyucuklarla gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- Her kuyucuğa 200 μL hücre kültürü dereceli (endotoksin içermeyen) su ekleyerek yapışkan kuyucukların sızdırmazlığını test edin. Oda sıcaklığında (RT) 60 dakika inkübe edin ve devam etmeden önce sızıntı olmadığından emin olun. PMMA kaplamasını bozmamaya dikkat ederek suyu aspire edin.
- Her kuyucuğa 300 μL endotoksin içermeyen su ekleyerek ve kalan çözücüyü çıkarmak için kullanmadan önce 1 saat (üç kez), 12 saat ve 24 saat inkübe ederek endotoksin içermeyen su yıkamaları gerçekleştirin.
- Hücre kültürü için kullanılacak slaytların endotoksin konsantrasyonunu test edin. 200 μL endotoksin içermeyen reaktif suyunu (Malzeme Tablosu) her slaytın bir oyuğunda 1 saat boyunca inkübe edin. Bir son nokta kromojenik endotoksin testi kullanarak ekstrakttaki endotoksin konsantrasyonunu ölçün (Malzeme Tablosu).
not: Aşağıdaki protokol, Malzeme Tablosunda listelenen endotoksin test kitine özgüdür.
- Bu iş için yalnızca pirojen içermediği (yani endotoksin içermediği) sertifikalı su ve sarf malzemeleri (yani pipet uçları, mikrosantrifüj tüpleri ve kuyu plakaları) kullanın. Ayrıca, polimer kaplı yüzeylerin hazırlanmasında kullanılan herhangi bir cam malzeme, kullanımdan önce kuru ısı sterilizasyonu (30 dakika boyunca 250 ° C) kullanılarak pirojene edilmelidir. Burada tarif edildiği gibi ekstrakt çözeltisindeki endotoksinin ölçülmesi, malzeme yüzeyindeki endotoksinin hafife alınmasına neden olabilir. Sonuç olarak, bir polimer kaplama protokolü geliştirirken, endotoksin tahlil reaksiyonunun (yani, test numuneleri [reaktif suyu] veya spike kontrolleri için adım 2.6.4−2.6.6) doğrudan kaplanmış numuneyi içeren kuyucuklar içinde gerçekleştirilmesi önerilir. kaplama işlemi sırasında sisteme yanlışlıkla endotoksin kaynağı sokulmamasını sağlamak.
- Tüm test örneklerini (yani ekstraktları) ve endotoksin tahlil reaktiflerini RT'ye getirin. Test tamponunda kromojenik reaktifi ve reaktif suyunda endotoksin standardını sulandırın, 5 dakika çözünmesine izin verin ve kullanmadan önce hafifçe döndürün. Kullanılmadığı zaman tüm şişeleri parafin film ile örtün.
- Reaktif suyunda endotoksin standardının seri seyreltmesini gerçekleştirerek, testin alt sınırından üst sınırına kadar değişen endotoksin standardının 5−8 noktalı standart seyreltme eğrisi oluşturun.
- Test numunelerinde endotoksin testinin arttırılmasını veya inhibisyonunu kontrol etmek için, kullanılmayan bir test numunesi çözeltisinde bilinen miktarda endotoksini seyrelterek pozitif bir kontrol (spike kontrolü veya spiked numune olarak da adlandırılır) hazırlayın.
not: Pozitif kontrolün konsantrasyonu, standart eğrinin ortasındaki bir standartla aynı konsantrasyon olmalıdır. Endotoksin spike'ın geri kazanılan miktarı (yani, pozitif kontrolün konsantrasyonu eksi çivilenmemiş test numunesinin konsantrasyonu) endotoksin spike'ın nominal konsantrasyonunun% 50-200'ü içindeyse, ekstraksiyon çözeltisinin teste önemli ölçüde müdahale etmediği düşünülebilir.
- 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna iki veya üç nüsha halinde 50 μL standart, numune veya spike kontrolü ekleyin. Negatif kontrol olarak reaktif suyu kullanın.
- Her kuyucuğa 50 μL kromojenik reaktif ekleyin. Reaktifi tüm kuyucuklara hızlı bir şekilde ekleyin. Tüm kuyucuklara reaktif eklemek için geçen süreyi kaydetmek için bir zamanlayıcı kullanın. Plakayı yapışkan bir conta ile örtün ve 37 °C'de inkübe edin (inkübasyon süresi partiye bağlıdır ve kromojenik reaktif kitinde bulunan Analiz Sertifikasında belirtilmiştir). Alternatif olarak, tüm standart kuyucuklarda bir renk değişikliği gözlenene kadar inkübasyon sırasında her 15 dakikada bir plakayı kontrol edin.
- İnkübasyondan sonra, reaksiyonu durdurmak için her oyuğa 25 μL %50 asetik asit ekleyin (oyuk başına nihai %10 asetik asit konsantrasyonu). Kromojenik reaktifin eklenmesiyle aynı sırayla asetik asit ekleyin. 405 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak plakanın emiciliğini okuyun. Sıvıyı aspire edin ve plakayı atın.
not: Asetik asit ilavesi, kromojenik reaktifin aldığı gibi her bir kuyucuğa eklemek için aynı süreyi almalıdır (± 30 s).
- Ultraviyole (UV) - hücre kültürü deneylerinden önce slaytları 30 dakika sterilize edin.
3. 3T3 Hücrelerinden Lizat Yapımı
- Birden fazla T3 şişesinde 3T150 hücrelerini %70 birleşmeye kadar büyütün. Hücreleri ayırmak için, ortamı aspire edin, yüzeyi 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve PBS'yi aspire edin. 5 mL hayvansal kökenli, rekombinant hücre ayrışma enzimi ekleyin ve 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
- Şişeyi hafifçe ileri geri eğerek hücreleri ayırın. Hücre ayrışması için kullanılan rekombinant enzimi nötralize etmek için 5 mL PBS ekleyin. Ayrılan hücreleri şişelerden bir santrifüj tüpüne aktarın ve pipetleme yoluyla karıştırın. Bir hemositometre ve hücre canlılığı boyası kullanarak canlı hücre sayımı yapın.
not: Lizat preparatına serum bazlı proteinlerin eklenmesini önlemek için PBS'de seyreltme yoluyla nötralize edilebilen bir hücre ayrışma enzimi seçildi. Hücreleri ayırmak için tripsin kullanılıyorsa, serum içeren bir çözelti ile nötralize edilmeli ve lizat preparatına taşınan serum proteinlerinin miktarını azaltmak için ek bir PBS yıkaması yapılmalıdır.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve kalan ortamları yıkamak için PBS'nin orijinal hacminde (yani 10 mL x şişe sayısı) hücreleri yeniden süspanse edin. Yinelemek.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. 1 x 106 hücre / mL'lik bir nihai hücre konsantrasyonu elde etmek için gereken PBS hacmini ekleyin. Hücre solüsyonunu, numune tamamen donana kadar (en az 80 saat) -2 °C'lik bir dondurucuya koyun.
- Hücre çözeltisini 37 ° C'lik bir su banyosunda çözdürün. Tamamen çözüldükten sonra, çözeltiyi tamamen donana kadar -80 °C dondurucuya geri koyun. Toplam 3 donma-çözülme döngüsü için tekrarlayın.
- Protein konsantrasyonunu belirlemek için çeşitli seyreltmelerde (örn. 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) hücre lizatı üzerinde bir mikro bikinkoninik asit (BCA) testi gerçekleştirin. Hücre lizatını 468.75 μg / mL'lik bir protein konsantrasyonuna seyreltin, alikot ve ileride kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
not: 48 oyuklu bir plakadaki nihai protein konsantrasyonu 125 μg/cm2'dir (bir oyuklu yüzey alanına bağlı olarak, 0.75cm2).
- Lizattaki DAMP'lerin varlığını değerlendirmek için bir Western lekesi uygulayın (ör., ısı şoku proteini 60 [HSP60], yüksek hareketlilik grubu kutusu 1 [HMGB1]) 1.5 mm kalınlığında% 10 poliakrilamid jel üzerine yükleme tamponunda 40-60 μg lizat proteini yükleyerek ve standart Western blot prosedürlerini izleyin.
4. Adsorbe Protein Katmanlarının ve Toll Benzeri Reseptörlerin Makrofajların NF-κB Aktivitesi Üzerine Etkisinin Değerlendirilmesi
>NOT: Deneysel iş akışının ve plaka düzeninin şeması için sırasıyla Şekil 1A ve Şekil 2'ye bakın.
- Muhabir makrofajlarını uygun büyüklükte bir şişede %70 birleşmeye kadar büyütün. Ortamı aspire edin, yüzeyi PBS ile yıkayın ve PBS'yi aspire edin. Rekombinant hücre ayrışma enzimini ekleyin ve 37 ° C'de 8 dakika inkübe edin.
- Şişenin kenarlarına sıkıca vurarak hücreleri ayırın. Eşit hacimde büyüme ortamı (% 10 FBS içeren) ekleyerek rekombinant hücre ayrışma enzimini inaktive edin. Bir hemositometre ve hücre canlılığı boyası kullanarak canlı hücre sayımı yapın.
not: Hücre ayrışma enziminde 8 dakikalık bir inkübasyonu takiben raportör makrofajlar için beklenen canlılık %90'dır.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri yıkamak için orijinal PBS hacminde yeniden süspanse edin. Tekrar santrifüjleyin ve hücreleri tahlil ortamında (ısıyla inaktive edilmiş FBS içeren) 7.3 x 105 hücre / mL'de yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu 3 farklı tüpe ayırın: TLR4 inhibitörü, anti-TLR2 ve tedavi edilmemiş. Hücreleri RT'de 60 dakika boyunca 1 μg / mL TLR4 inhibitörü ile veya RT'de 30 dakika boyunca 50 μg / mL anti-TLR2 ile inkübe edin.
- 200 μL lizat,% 10 FBS,% 10 ticari fare plazması (Malzeme Tablosu) veya protein çözeltilerinin bir karışımını 48 oyuklu bir plakaya (veya eşdeğeri) ekleyin ve proteinin istenen süre boyunca 37 ° C'de adsorbe olmasına izin verin (ör., 30 dakika, 60 dakika veya 24 saat). Her protein çözeltisi için taze bir Pasteur pipeti kullanarak kuyucuklardan protein çözeltilerini aspire edin ve yüzeyleri 5 dakika boyunca 250 μL PBS ile yıkayın. Toplam 3 yıkama için tekrarlayın.
not: Bu adımın, istenen adsorpsiyon süresine bağlı olarak protokolde daha erken başlatılması gerekebilir. Protokolü buna göre ayarlayın.
- TLR4 inhibitörü veya anti-TLR2 ile inkübasyon süresinden sonra, hücreleri yeniden süspanse etmek için pipetleyin. Her oyuğa 200 μL hücre çözeltisi ekleyin.
- TLR2 pozitif kontrol koşulu için, 150 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser-(Lys)4) ekleyin. TLR4 pozitif kontrol koşulu için, 1.5 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona lipopolisakkarit (LPS) ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de 20 saat inkübe edin.
- Her bir oyuktan 20 μL süpernatan numune alın ve 96 oyuklu bir plakaya iki kez plaka ekleyin. Arka plan kontrolü olarak 20 μL'lik üç kuyu tahlil ortamı ekleyin. Her oyuğa 200 μL SEAP raportör tahlil reaktifi ekleyin. Plakayı yapışkan bir conta ile örtün ve 37 °C.
'de 2,5 saat inkübe edin
not: Kuluçka süresi, deneysel koşullara bağlı olarak değişebilir ve pozitif ve negatif kontrol kuyuları arasındaki absorbansta güçlü bir fark için optimize edilmelidir.
- Süpernatantın geri kalanını 1.5 mL'lik bir tüpe (kuyucuk başına) aktarın. Herhangi bir kalıntıyı peletlemek için 1.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve -80 ° C'de saklayın. Proinflamatuar sitokinlerin varlığı için süpernatanı analiz edin (ör., Tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α), interlökin 6) enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) yoluyla.
- Yapışkan plaka contasını çıkarın. 635 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak plakanın emiciliğini okuyun. Sıvıyı aspire edin ve plakayı atın.
