1. CAR kodlayan lentivirüsün üretilmesi
NOT: Spesifik kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücresi plazmit yapısı tamamlandıktan sonra (CD47 ve diğerleri), lentiviral CAR'lar, 293 FT hücresi, bir lentiviral paketleme karışımı ve transfeksiyon ajanları (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılarak standart prosedürle üretilir. Daha sonra, üreticinin protokolüne göre lentiviral RNA miktarını ölçerek virüs titresini belirlemek için kantitatif bir ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kiti ve bir termal döngüleyici (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Tüm lentiviral prosedürlerin kesinlikle güvenlik gerekliliklerine uygun olarak gerçekleştirilmesi önemlidir.
- Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerinde (DMEM) 15 x10 6 HEK293FT hücreleri tohumlayın ve hücreleri nemlendirilmiş% 5 karbondioksit (CO2) inkübatörü içinde 150 mm'lik bir tabakta 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- Transfeksiyon kompleksi olan iki adet 15 mL tüp hazırlayın. İlk tüp, 2.5 mL transfeksiyon seyreltme çözeltisinde lentiviral vektör plazmid DNA (5 μg) ve lentiviral ambalaj karışımı (22.5 μg) içerir. İkinci tüp, 2.5 mL transfeksiyon seyreltme çözeltisinde 82.5 μL transfeksiyon reaktifi içerir (bkz. Malzeme Tablosu).
- Tüp 1'in içeriğini tüp 2'ye pipetleyin ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Tüpün içeriğini damla damla HEK293FT hücreli bir tabağa aktarın ve numuneyi gece boyunca 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 karbondioksit, CO2 inkübatörde inkübe edin.
- Ertesi gün, mevcut ortamı 19 mL taze DMEM kültür ortamı ile değiştirin ve hücreleri gece boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe etmeye devam edin.
- Ortamı çanaktan 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Virüs içeren besiyerinin bulunduğu tüpü buzdolabında saklayın.
- Yukarıdaki işlemi tekrarlayın, taze DMEM ekleyin ve 1 gün sonra tekrar toplayın.
- Ortamın iki koleksiyonunu tek bir santrifüj tüpünde birleştirin. Tüpü 4 ° C'de 30 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin.
- Lentivirüs içeren süpernatantın çoğunu ultra berrak bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreler ve/veya kalıntılar içerebilecek peletleri rahatsız etmekten kaçınmak için minimum hacimde, yaklaşık 1 mL süpernatan bırakın.
- Yukarıda arıtılmış süpernatanı 110.000 x g'da 4 ° C'de 100 dakika boyunca ultrasantrifüj edin.
- Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve tüpün altındaki virüs peletine nazikçe 100 μL DMEM ortamı ekleyin. Tüpü 15 dakika buz üzerinde bırakın. Solüsyonu nazikçe karıştırın ve lentivirüs solüsyonunu önceden soğutulmuş steril tüplere alın. Bu virüs stok tüplerini -80 °C dondurucuda saklayın.
- Lentiviral RNA'yı çıkaran ve ölçen üreticinin protokolüne göre lentivirüsün titresini belirlemek için kantitatif bir RT-PCR kiti kullanın.
2. CAR T hücrelerinin üretilmesi ve genişletilmesi
- Önceden dondurulmuş insan periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) (yaklaşık 1 x 106 ila 2 x 106 hücreli) eşit sayıda CD3 / CD28 kaplı mikro boncuk ile 1 mL CAR T hücresi ortamında aktive edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücreleri 24 saat boyunca nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
- Lentivirüs stoğunun bir kısmını buz üzerinde çözdürün.
- Hücrelerle birlikte kuyuya 1 μL transdüksiyon arttırıcı ajan ekleyin ve karıştırın.
- Hücrelere 5:1 oranında enfeksiyon çokluğu (MOI) ile lentivirüs ekleyin ve hafifçe karıştırın. Ertesi gün, bu adımı tekrarlayın (ilk transdüksiyondan 24 saat sonra).
- Her 2-3 günde bir T hücresi büyümesini izleyin. Hücreleri 1 x 106 ila 2 x 106 hücre / mL yoğunlukta tutmak için daha fazla taze CAR T hücresi ortamı ekleyin.
- CAR T hücrelerini bir dondurma çözeltisi kullanarak standart bir protokolle dondurun (Malzeme Tablosuna bakın).
- CAR T hücrelerini standart bir yöntem kullanarak çözün ve teste uygulamadan önce interlökin-2, IL-2 (300 birim / mL) ile yaklaşık ~ 2-4 saat boyunca CAR T hücresi ortamında ön kültürleyin.
>3. Akış sitometrisi ile CAR ekspresyonunun tespiti
- 3 x 105 CAR T hücrelerini ve transdüksiyonsuz T hücrelerini iki ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Tüpleri 2 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve hücreleri% 1 insan serumu içeren 200 μL floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunda yeniden süspanse edin.
- 100 μL hücre solüsyonunu iki adet 5 mL polistiren FACS tüpüne pipetleyin ve tüpleri 5 dakika buz üzerinde tutun.
- Her hücre tipinin bir tüpüne 1 μL biyotinile keçi anti-fare F (ab ') 2 ekleyin. Daha sonra, her hücre tipinin diğer tüpüne PE etiketli bir anti-etiket antikoru olan 2 μL fikoeritrin ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). İyice karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Hücreleri her tüpte 3 mL FACS tamponu ile yıkayın ve tüpleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin; süpernatanları atın ve çok kısa bir süre girdap yapın veya kalan sıvıdaki hücreleri yeniden süspanse etmek için tüpleri kısaca sallayın.
- Her tüpe 2 μL antijen sunan hücre (APC) anti-CD3 ve 2 μL 7-Aminoaktinomisin D (7-AAD) antikor çözeltisi ekleyin (bkz. Anti-F (ab ') 2 Ab ile boyanmış hücrelerin tüpüne 1 μL PE etiketli streptavidin ekleyin. Kısa bir süre karıştırın ve tüpleri 30 dakika daha buz üzerinde inkübe edin.
- Hücreleri adım 3.5'te açıklandığı gibi tekrar yıkamak için FACS tamponunu kullanın ve her tüpe ek 200 μL FACS tamponu ekleyin.
- Hücreleri analiz etmek için akış sitometrisini kullanın, önce T hücreleri üzerinde ileri saçılma ve yan saçılma grafiğinde geçit yaparak ve ardından bir CD3'e karşı 7-AAD grafiğinde canlı hücreler (7-AAD-negatif) üzerinde geçit oluşturarak. Son adım, anti-tag, anti-ScFv veya anti-F(ab')2 ile CD3'ü analiz etmektir.
>4. Gerçek zamanlı sitoliz potens testi (RTCA)
NOT: RTCA testini üreticinin önerdiği koşullara göre gerçekleştirin. Kısaca, hedef hücreleri önce E-Plakanın kuyucuklarına plakalayın, ardından ertesi gün CAR T hücrelerinin eklenmesi ile takip edin. CAR T hücrelerinin hedef hücrelere karşı sitoliz aktivitesi gerçek zamanlı olarak izlenir. T hücreleri ve sahte transdüksiyonlu T hücreleri (Mock CAR T hücreleri) negatif efektör hücre kontrolleri olarak kullanılır. Aşağıdaki protokol, yapışık tümör hücre hatları için in vitro gerçek zamanlı bir sitoliz potens testini açıklar.
- xCELLigence E-Plakasının her bir oyuğuna 100 μL hedef hücre kültürü ortamı ekleyin, plakayı xCELLigence cihazının içine yerleştirin ve bir arka plan okuması yapın. Ardından, E-Plakayı hücre tohumlaması için bir doku kültürü başlığına aktarın.
- Kültür cihazından hedef kanser hücrelerini tripsize etmek için standart bir protokol kullanın. Daha sonra hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 15 mL'ye kadar taze kültür ortamı ekleyin. Hücreleri 200 x g'da 5 dakika santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı atın, 5 mL taze ortam ekleyin ve hücre peletini nazikçe yeniden süspanse etmek için serolojik bir pipet kullanın. Bir hemositometre ve mikroskop kullanarak canlı hücrelerin yoğunluğunu sayın.
- Hücre yoğunluğunu uygun şekilde ayarlayın ve ardından E-Plate'in her bir oyuğuna 100 L hücre süspansiyonu ekleyin. Hedef hücre sayısı tipik olarak yapışık hücre hatları (BxPC3, Hela-CD19 ve SKOV3) için yaklaşık 10.000 hücre/kuyu veya Raji gibi süspansiyon hücreleri için 30.000 hücre/kuyudur (sıvı kanser hücrelerini bağlamak için kuyucukların antikorlarla önceden kaplanmasıyla ilgili ayrıntılar için aşağıya bakın).
- Hücrelerin kuyu dibine eşit şekilde yerleşmesini sağlamak için E-Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika dengeleyin (bu çok önemlidir; bu adımı atlamayın).
- E-Plakayı hücre kültürü inkübatörünün içindeki xCELLigence cihazına yerleştirin ve her 15 dakikada bir otomatik olarak Hücre İndeksi ve zaman olarak görüntülenen empedansı ölçmeye başlayın.
- Ertesi gün, efektör CAR T hücrelerini hazırlayın. Tüm hücrelerin aynı anda hazır olduğundan emin olmak için uygun kontrolleri (yani, Sahte CAR T hücreleri, dönüştürülmemiş kontrol T hücreleri ve/veya ilgisiz CAR T hücreleri) önceden hazırladığınızdan emin olun. Efektör hücreleri ve kontrol hücrelerini uygun yoğunluğa ayarlayın ve 9. adımda her bir oyuğa 100 μL efektör hücre süspansiyonu eklendiğinde istenen E: T oranlarının elde edilmesini sağlamak için seri seyreltmeler hazırlayın.
- xCELLigence veri toplamayı duraklatın ve E-Plakayı inkübatörden bir hücre kültürü başlığına getirin.
- Her kuyucuktan 100 μL ortam çıkarın. Her bir kuyucuğundaki artık ortam miktarı artık 100 μL'dir.
- İstenen E: T oranlarını elde etmek için 100 μL seri seyreltilmiş efektör CAR T hücreleri veya diğer kontrol hücreleri (yani Sahte CAR T hücreleri) ekleyin.
- Efektör hücrelerin yerleşmesine izin vermek için E-Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika dengeleyin ve ardından E-Plakayı tekrar xCELLigence cihazına yerleştirin. Veri toplamaya devam edin.
- İstenirse, önemli zaman noktalarında xCELLigence veri toplama duraklatılabilir ve ortogonal deneylerle analiz edilecek küçük numuneleri toplamak için plaka çıkarılabilir (yani, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) veya akış sitometrisi ile sitokin üretiminin ölçülmesi).
- EGFR-GITR-CD3 CAR T-hücresi deneyinde, bir ELISA kiti ile interferon-gama (IFNy) verimini ölçün (üreticinin talimatlarını izleyin; Malzeme Tablosuna bakın).
not SIVI KANSERLERİN KULLANIMI İLE İLGİLİ: Yapışık olmayan hematolojik kanser hücrelerini test etmek için, hücreler eklenmeden önce E-Plate'in kuyucukları ilk olarak kanser hücrelerinin yüzeyinde eksprese edilen bir antijene özgü bir antikor ile kaplanır. Raji B hücre hattı için, anti-CD40 bazlı bir bağlama reaktifi kullanılır (Malzeme Tablosundaki sıvı tümör öldürme tahlil kitine bakınız). Plakayı kaplama prosedürü aşağıdadır:
- Bağlama reaktifini (anti-CD40) bağlama tamponu ile 4 μg/mL'lik bir konsantrasyona seyreltin.
- Bir doku kültürü başlığı içinde çalışarak, E-Plakanın her bir oyuğuna 50 μL seyreltilmiş bağlama reaktifi ekleyin. E-Plakayı oda sıcaklığında veya 37 °C inkübatörde 3 saat bekletin.
- Bağlama reaktifini çıkarın ve E-Plakayı yıkama tamponu ile en az 2 kez yıkayın. Bu noktada, E-Plate, Raji hedef hücrelerini (30.000 hücre / kuyu) tohumlamak için hazırdır.
- Prosedürün geri kalanını gerçekleştirmek için adım 4.1 (yukarıda) ile devam edin.
