TNFa'ya Karşı Antikorların Anti-Apoptotik Aktivitesini Belirlemek için İn Vitro Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Tierrablanca-Sánchez, L., et al. İn Vitro Biyoanalitik Yöntem Kullanılarak TNF'yi Nötralize Ederek Bir Anti-TNF Monoklonal Antikorun (mAb) Göreceli Potansiyelinin Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, inflamatuar bir sitokin olan tümör nekroz faktörü-alfa'ya (TNFa) karşı antikorların etkinliğini in vitro biyoanalitik bir yaklaşımla değerlendirmek için bir tekniği göstermektedir. TNFa, stresli hücrelere girdiğinde apoptozu tetikler. Bununla birlikte, antikorlara bağlanma TNFa'yı sınırlayarak apoptozu önler. Apoptoz derecesi, bir biyolüminesans testi kullanılarak ölçülür.

Protokol

1. Ortamın ve Çözümlerin Hazırlanması

1. Kültür ortamını hazırlayın:% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile RPMI-1640, pH 7.4.
2. Tahlil kültürü ortamını hazırlayın: fenol kırmızısı içermeyen ancak %1 FBS, pH 7.4 ile RPMI-1640.
3. Hücre yıkama solüsyonu hazırlayın: Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) %0.02 EDTA, pH 7.4 içeren Mg ve Ca içermeyen solüsyonu.
4. Hücre ayırma çözeltisi hazırlayın: 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile% 0.125 tripsin.
   1. 100 mL% 0.25'lik bir tripsin-EDTA çözeltisi çözülür ve steril 500 mL'lik bir şişeye aktarılır.
   2. 100 mL hücre yıkama solüsyonu ile karıştırın ve 15 mL alikotları 15 mL steril tüplere dağıtın. Kullanana kadar -70 ila -80 °C'de saklayın.
   3. Bu çözeltileri 0,22 μm'lik bir membrandan süzün ve kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca 37 °C'ye kadar ısıtın.
5. 3.3 μg / mL'de apoptoz-indüksiyon stok çözeltisi TNFα çözeltisi hazırlayın.
   1. 20 μg TNFα'yı 500 μL filtreyle sterilize edilmiş su ile birincil kabında çözün ve tamamen çözünene kadar karıştırın.
   2. 15 mL'lik steril bir tüpe aktarın ve bu tüpe 5.5 mL DPBS Mg ve Ca içermeyen solüsyon ekleyin. Bir girdap karıştırıcı kullanarak hafifçe karıştırın.
   3. Çözeltiyi 70 μL'lik porsiyonlara ayırın. Her bir alikotu 0,5 mL mikrotüplere dağıtın ve -80 ° C'de saklayın.
6. Apoptoz indüksiyon çözeltisi hazırlayın: 40 ng / mL'de TNFa çözeltisi.
   1. Apoptoz indüksiyon stok çözeltisinin bir kısmını çözün, 25 ° C'de 10 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin.
   2. 15 mL'lik steril bir tüpte 4.939 mL tahlil kültürü ortamına 61 μL 3.3 μg/mL TNFα çözeltisi ekleyerek apoptoz indüksiyon stok çözeltisini 40 ng/mL'ye seyreltin.
   3. Bir vorteks karıştırıcı ile 10 saniye karıştırın; Bu çözelti kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır.
   4. Nötralizasyon testinde kullanmadan önce çözeltiyi en az 30 dakika 37 ° C'ye ısıtın.
7. Substrat çözeltisini hazırlayın: kaspaz 3/7 Glo çözeltisi.
   1. Kaspaz tampon çözeltisini (kaspaz 3/7 Glo tamponu) kullanmadan önce 12 saat boyunca çözdürün.
   2. Kaspaz tampon çözeltisini ve substratı (kaspaz 3/7 Glo substratı) karıştırmadan önce 25 ± 5 °C'de 30 dakika ayrı ayrı bekletin.
   3. 10 mL kaspaz tampon çözeltisini substrat şişesine aktarın ve ters çevirerek karıştırın.
   4. Kullanana kadar 25 ± 5 °C'de, ışığa karşı koruyun.
      not: Çözelti, oda sıcaklığında 6 saat boyunca stabildir.

2. Hücre Kültürü ve Sayımı

1. Hücre çözülmesi ve ilk alt kültür.
   1. WEHI 164 hücreli bir şişeyi -80 °C'deki bir dondurucudan çıkarın ve bir buz banyosuna aktarın.
   2. Donmuş hücreler tamamen çözülene kadar 1 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı ile yukarı ve aşağı pipetleyin.
   3. 9 mL önceden ısıtılmış kültür ortamını 15 mL steril bir tüpe dağıtın.
   4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik steril tüpe aktarın ve ters çevirerek beş kez hafifçe karıştırın.
   5. Hücre süspansiyonunu 3 dakika boyunca 125 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini ayrıştırın.
   6. Tüpe 5 mL kültür ortamı ekleyin. Hücreler tamamen yeniden süspanse olana kadar karıştırın.
   7. Hücre sayımı için, 50 μL hücre süspansiyonunu 500 μL'lik bir mikrotüpe aktarın ve 50 μL% 0.4 tripan mavisi ile karıştırın. Hücreleri sayın ve 0,5 x 10⁶ hücre/mL olarak ayarlayın. Aşağıdaki adım 2.2'ye bakın.
   8. 75 mL'lik bir hücre kültürü şişesine 13 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.
   9. Hücre kültürü şişesinde 0.5 x 10⁶ hücre / mL elde etmek için adım 2.1.6'dan yeterli hücre süspansiyon hacmini dağıtın ve gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
2. Hücre sayımı.
   1. Adım 2.1.6'daki çözeltiyi kullanarak, 0.05 mL'yi bir hemositometreye aktarın ve tripan mavisi dışlamasını kullanarak mikroskop altında hücre yoğunluğunu belirleyin.
   2. Toplam hücre ve canlı hücre sayısını ölçün.
   3. Hücre süspansiyonlarını 0,5 x 10⁶ hücre/mL.
      olarak ayarlayın V_{kültür ortamı}(mL) =
      V_{kültür ortamı} (mL) = (5 mL - V_{hücre süspansiyonu})
      V_{kültür ortamı} (mL) = Düzeltilmiş WEHI 164 hücre süspansiyonu hacmi
      NVC = Canlı WEHI sayısı 164 hücre/mL
      V_{kültür ortamı} (mL) = 0.5 x 10⁶ hücre / mL / br / > elde etmek için hücre süspansiyonuna eklenen tahlil kültürü ortamı hacmi < 0,5 x 10⁶ = Hedef hücre yoğunluğu
3. Hücre dekolmanı ve ikinci ve üçüncü alt kültürler.
   not: Çözeltileri şişelerden çıkarmak için bir vakum sistemi kullanılabilir. Tek kullanımlık veya cam steril pipetler kullanılabilir. Pipetin üst kısmında pamuk tıkanıklığı varsa, kullanmadan önce çıkarılmalıdır.
   1. 1 mL steril pipet ve vakum kullanarak kültür ortamını hücre kültürü T-şişesinden çıkarın.
   2. 5 mL hücre yıkama solüsyonunu kültür T-şişesine dağıtın, hafifçe karıştırın ve solüsyonu atın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
      not: Kültür ortamının tamamen çıkarılması, verimli hücre ayrılması için kritik öneme sahiptir.
   3. T-şişesine 15 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatörde 3 dakika bekletin.
   4. Mikroskop altında şişenin iç duvarında bağlı hücrelerin olmadığını doğrulayın. 20 mL'lik steril bir pipet kullanarak hücreleri kültür T-şişesinden çıkarın ve bunları 50 mL'lik steril bir tüpe dağıtın.
   5. Hücre süspansiyonunu 3 dakika boyunca 125 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti başka bir 5 mL kültür ortamı ile yeniden süspanse edin.
   6. Hücreleri sayın ve Denklem 1'e göre istenen hücre konsantrasyonuna ulaşmak için yeterli kültür ortamı ekleyin.
   7. Bu süspansiyonu 72^cm2'lik bir T-şişeye ekleyin ve gece boyunca 37 °C ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
   8. Nötralizasyon tahlilinde kullanmadan önce hücreleri en az iki kez alt kültüre alın. Sonraki iki gün boyunca 2.3.1-2.3.8 adımlarını tekrarlayın.
4. Tahlil hücresi süspansiyonu.
   1. En az üç geçişi olan bir WEHI 164 alt kültürü seçin. Adım 2.1'e bakın.
   2. Hücreleri bu protokolün 2.2 ve 2.3 adımlarına göre ayırın ve sayın.
   3. Hücre süspansiyonunu Denklem 1'e göre 0.5 x 10⁶ hücre / mL'ye göre seyreltin.
   4. Nötralizasyon testi için bu hücresel süspansiyonu kullanın. Kullanmadan önce tüm hücre süspansiyonlarını bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın.

3. Antikor Hazırlama ve Dilüsyonlar

1. mAb'lerin nicelikçiliği.
   1. Kütle sönme katsayılarını (1,39) kullanarak 280 nm'de UV absorpsiyonu yoluyla referans maddenin, kontrol numunesinin ve analitik numunenin konsantrasyonunu belirleyin.
      not: Orijinal konsantrasyonlar ilaç ürün etiketlerinden alınabilir. Bununla birlikte, bu UV absorpsiyonu ile doğrulanmalıdır.
2. mAb seyreltmeleri.
   1. Tüm numuneleri bağımsız olarak üç kopya halinde, DPBS Mg ve Ca içermeyen çözelti ile 2 mL mikrotüplerde 2 mg / mL'ye kadar seyreltin. Bu konsantrasyonu, boşluk olarak DPBS Mg ve Ca içermeyen çözelti kullanarak üç kopya halinde UV absorpsiyonu ile onaylayın.
   2. Stok protein çözeltilerini bir girdap karıştırıcı kullanarak 5 saniye karıştırın.
   3. Her 2 mg / mL mAb çözeltisinin 100 μL'sini 0.9 mL tahlil kültürü ortamı ile seyreltin.
   4. Bir vorteks karıştırıcı ile 5 saniye karıştırın.
      not: Bu çözeltiler 200 μg/mL'lik bir konsantrasyona sahiptir. Her üçlü kopya için seyreltme yapılmalıdır.
   5. Her 200 μg / mL mAb çözeltisinin 10 μL'sini 0.99 mL tahlil kültürü ortamı ile seyreltin. Bir vorteks karıştırıcı kullanarak 5 saniye karıştırın. Bu çözeltiler 2 μg/mL'lik bir konsantrasyona sahiptir. Nötralizasyon tahlilinde kullanmadan önce her üçlü için seri seyreltmeler gerçekleştirin.
   6. Üç bağımsız mikroplakada anti-TNFα mAb seyreltmeleri yapın. Her bağımsız üçlüden bir kopya yapın ve bunları Tablo 1'de gösterildiği gibi bir mikroplaka içinde dağıtın. Referans Madde
   7. Tablo 2.
      'da gösterildiği gibi her referans, numune veya kontrolün mAb seyreltmelerini gerçekleştirin not: Bu tabloda tarif edilen anti-TNFα mAb konsantrasyonları, nötralizasyon testindeki nihai konsantrasyonlar değildir.
   8. Plakaları kullanana kadar 25 ± 5 °C'de tutun.

4. WEHI 164 Hücreleri ile Nötralizasyon Testi

1. Bu protokolün herhangi bir adımında dağıtmadan önce tüm hücre süspansiyonlarını (0.5 x 10⁶ hücre / mL) girdaplayarak karıştırın.
   not: Bu bölümde, kullanmadan önce her bir çözeltiyi 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtın.
2. 50 μL hücre süspansiyonunu, mikroplakaların 60 kuyucuğunun her birine aktarın, sütun 2'den 11'e ve B hattından G'ye hareket edin.
3. 50 μL mAb referansı, numune ve kontrol seyreltmelerini mikroplakalara aktarın. Şekil 1'de gösterilen modeli takip edin.
4. Her oyuğa 50 μL apoptoz indüksiyon çözeltisi ekleyin.
5. Üç oyukta dağıtılan 50 μL WEHI 164 hücresinin hücresel kontrollerini kullanın. Her bir oyuğu bir tahlil kültürü ortamı ile 150 μL'lik bir son hacme getirin.
6. 50 μL WEHI 164 hücresi artı 50 μL apoptoz indüksiyon çözeltisi karışımının sitotoksisite kontrolünü kullanın. Her bir oyuğu bir tahlil kültürü ortamı ile 150 μL'lik bir son hacme getirin.
7. TNFα kontrolü için 50 μL apoptoz indüksiyon solüsyonu kullanın ve tahlil kültürü ortamı ile 150 μL'ye getirin.
8. Boşluk için, tek başına 150 μL tahlil kültürü ortamı kullanın.
9. Plaka buharlaşma etkilerini önlemek için kalan kuyucukları 150 μL kültür ortamı ile doldurun.
10. 4.1.1-4.1.9 adımlarını diğer iki mikroplakada iki kez tekrarlayın.
    not: Mikroplakadaki mAb nihai konsantrasyonları şunlardır: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 ve 0.004 μg / mL.
11. Numuneleri Şekil 1'de gösterildiği gibi mikroplakalara yükleyin
12. Üç plakayı 37 ° C ve% 5 CO_2'de 16 ± 2 saat inkübe edin.
13. Kaspaz 3/7 Glo reaktifini kullanmadan önce 25 ± 5 °C'de 30 dakika bekletin.
14. Numuneler ve kontroller dahil olmak üzere tüm kuyucuklara bu reaktiften 100 μL ekleyin.
15. Kuyucuklara dağıttıktan hemen sonra plakaları bir mikroplaka girdap karıştırıcısı kullanarak 25 ± 5 ° C'de 3 dakika çalkalayın.
16. Plakaları ışıktan koruyarak 25 ± 5 ° C'de 2,5 ± 0,5 saat inkübe edin.
17. Mikroplakaları luminometreye yerleştirin ve sonraki bölümü tamamlayın.

5. Sonuçların Analizi

1. Lüminesans algılama için yazılımı kullanarak, lüminesans modunu ve uç nokta işlevini seçin.
2. Sütun 1 ve 12 hariç olmak üzere 96 oyuklu bir açık tabanlı plaka ve 80 iç kuyusu seçin.
3. Okumadan önce mikroplakayı karıştırmak için 1.250 ms ve 10 s'lik bir entegrasyon süresi seçin.
4. Referans maddenin, analitik maddenin ve kontrol numunesinin yerleştirileceği kuyucukları seçin ve bunları karşılık gelen konsantrasyonları ile tanımlayın.
5. Mikroplakalara yerleştirilen numuneleri luminometre ile okuyunuz.
6. Sonuçların analizi için dördüncü bir parametre denklemi kullanın. Şekil 2.
   'da gösterildiği gibi bir doz-yanıt eğrisinin grafiğini çizin NOT: Dördüncü parametre denkleminde C, etkin konsantrasyon 50'dir (EC50). Bu değer, efektör fonksiyonu aracılığıyla referans maddeyi, analitik numuneyi ve kontrol numunesini karşılaştırmak için kullanılacaktır.
7. Bağıl potansları hesaplamak için referans maddeyi 0'e sabitleyin, numunenin potanslarını hesaplayın ve buna göre kontrol edin.
   not: Bu değerler Şekil 3'te gösterilmiştir.

Tablo 1: Mikroplaka örnek dizileri. Tam bir nötralizasyon testi, B2 ila G11 koordinatları içindeki üç mikroplakada çalıştırılmalıdır. Referans, analitik ve kontrol örneklerinin rastgele dağıtılması, araştırmacıların tahlildeki herhangi bir yanlılığı doğrulamasına olanak tanır.

Plaka 1		Plaka 2		Plaka 3
Wells	örnek	Wells	örnek	Wells	örnek
B2: B11	Referans Madde	B2: B11	Kontrol Örneği	B2: B11	Analitik Örnek
C2:C11		C2:C11		C2:C11
D2:D11	Analitik Örnek	D2:D11	Referans Madde	D2:D11	Kontrol Örneği
E2:E11		E2:E11		E2:E11
F2:F11	Kontrol Örneği	F2:F11	Analitik Örnek	F2:F11	Referans Madde
G2:G11		G2:G11		G2:G11

Tablo 2: Anti-TNFα mAb dilüsyonları. Anti-TNFα mAb'lerin seri dilüsyonları bu tabloda gösterilmiştir. Bu tabloda açıklanan nihai konsantrasyonlar, anti-TNFα mAbs'nin 3 faktör (mAb seyreltme + kültür ortamı + hücre süspansiyonu) ile seyreltildiği tahlildeki konsantrasyonlar değildir. Kalın yazılan satırlar, 3, 5, 7, 9 ve 10. satırlardan gelen seyreltmeleri temsil eder; Kalın olmayan çizgiler, 3, 4 ve 6. satırlardaki seyreltmeyi temsil eder. Bu seri seyreltmeler, nötralizasyon testi yapılmadan hemen önce yapılır. Seyreltmeleri dağıtmadan önce üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırmaya özen gösterilmelidir.

Yılı

Plaka Sütunu	Tahlil kültürü ortamının hacmi (μL)	Referans Madde, Analitik Numune veya Kontrol Numunesi Hacmi (uL)	Test Plakasındaki Konsantrasyon (ng / mL)
2	0	230	2000
3	150	2. satırdan 150	1000
4	75	3. satırdan 75	500
5	100	3. satırdan 50	333
6	75	4. satırdan 75	250
7	75	75. satırdan 5	166
8	75	75 satırdan 6	125
9	75	75. satırdan 7	83
10	75	9. satırdan 75	41
11	150	75 numaralı satırdan 10	13

Sonuçlar

Şekil 1: Numunelerin tahlil plakalarına atılması. B1 ila G11, mikroplakalardaki iyi koordinatlardır ve numune seyreltmelerinin yerleştirildiği konumları tanımlar. Eksik koordinatlar, kontroller ve tahlil kültürü ortamı (A1-A12 ve H1-H12) ile doldurulmuş kuyulardır. Numunelerin bu rastgele dağılımı (mikroplakalardaki ileri ve geri seyreltmeler), ortamın buharlaşması veya diğer değişkenler nedeniyle son...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
WEHI 164	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-1751	Mus musculus'tan fibrosarkom hücreleri
RPMI-1640 Orta	ATCC (Uzay Servisi)	30-2001	Ortamı 2 °C ila 8 °C arasında saklayın
RPMI 1640 Orta, fenol kırmızısı yok	GIBCO Bilişim Teknolojileri	11835-030	Ortamı 2 °C ila 8 °C arasında saklayın
Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı	GIBCO Bilişim Teknolojileri	25200-056	Ortamı -10 °C ila -20 °C arasında saklayın
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	GIBCO Bilişim Teknolojileri	14190-136	Ortamı 2 °C ila 8 °C arasında saklayın
Rekombinant İnsan TNF-alfa Proteini	Ar-Ge Sistemleri	210-TA-020	-20 °C ile -70 °C arasında saklayın
Fetal Sığır Serumu (ABD), Süper Düşük IgG	HyClone (Klon	SH3089803	-10 °C ila -20 °C arasında saklayın
Fetal sığır serumu (ABD), karakterize edilmiş	HyClone (Klon	SH3007103	-10 °C ila -20 °C arasında saklayın
Caspase-Glo 3/7 Test kiti	Promega	G8093	Caspase-Glo'yu saklayın. 3/7 Substrat ve Caspase-Glo. 3/7 –20 ºC'de tampon Işıktan korunur
EDTA, Disodyum Tuzu, Dihidrat, Kristal, ACS Reaktifi	J.T.Fırıncı	8993-01	--
Örnek mAb adalimumab	Probiyomed	Na	Mikroplakadaki nihai konsantrasyonlar şunlardır: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 ve 0.004 μg / mL
Referans ve Kontrol mAb Adalimumab	Kısaltma	Na	Mikroplakadaki nihai konsantrasyonlar şunlardır: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 ve 0.004 μg / mL
Mikroplaka Okuyucu	Moleküler Cihazlar	89429-536	SpectraMax M3 Çok Modlu
Mikroplaka okuyucu Yazılımı	Moleküler Cihazlar	--	SoftMax Pro 6.3 GxP
kuvöz	Revco Belediyesi	30482	Revco RNW3000TABB Cebri Hava CO2
Laminer Akış Başlığı	Fırıncı Şirketi	200256	Fırıncı SG603A-HE | Yüksek Verimlilik, Sınıf II Tip A2

Serisi ) ) Fuar Serisi