1. Naif MoDC'lerin Üretimi
>NOT: Tam kan örnekleri, patojen içermeyen tek bir buzağıdan, heparinize vakutainer ile juguler ven ponksiyonu ile elde edildi (bu çalışma için sekiz adet 9 mL kan tüpü kullanıldı). Kanı bir buz kutusunda taşıyın. Numuneleri daha sonra kullanmak üzere 2-4 °C'de saklayın veya hemen işleyin. Kanın pıhtılaşmasını önlemek için kanın dönmesini sağlayın. Vakumları %70 etanol ile sterilize edin. Aşağıdaki tüm deneyler bir biyolojik numune ve altı teknik kopya ile gerçekleştirildi.
- PBMC'leri heparinize kandan izole etmek için yoğunluk gradyanlı santrifüjleme
- Kanı 10 kez ters çevirerek iyice karıştırın.
- 10 mL'lik bir pipet kullanarak, 20 mL heparinize kanı steril 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin.
- Steril 50 mL'lik bir tüpe 15 mL lenfosit izolasyon ortamı pipetleyin.
not: Pipetlemeden önce lenfosit izole edici ortamın oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin.
- Lenfosit izolasyon ortamını içeren 50 mL'lik tüpü 45 ° 'lik bir konuma eğin. 25 mL'lik bir pipetin ucunu dik olarak doğrultun ve 30 mL kan-PBS'yi ikisini karıştırmadan lenfosit izolasyon ortamının üzerine dikkatlice yerleştirin. Çok yavaşça, 50 mL'lik tüpü dikey konuma getirin.
- Maksimum hızlanma ile ve frenleme olmadan 20 ° C'de 35 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin (yavaşlama fonksiyonu kapalı).
- PBMC katmanını (ilk plazma katmanından hemen sonraki ince beyaz katman) toplamak için bir Pasteur pipeti kullanın ve 50 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
not: Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, tam kanı farklı katmanlara ayırır. Sonuç olarak, eritrositler bir pelet olarak dibe çöker, mononükleer hücreler (PBMC'ler) arayüz katmanına yerleşir ve plazma üst katmanı oluşturur. Granülositler, pelet ve PBMC tabakası arasında bulunur.
- Hasat edilen PBMC'leri 2 mL hacme kadar PBS ekleyerek ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırarak 40 kez yıkayın. Ardından, maksimum hızlanma ve maksimum yavaşlama ile 7 dakika boyunca 500 × g'da 4 g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı dekantasyon ile atın, peleti 15 mL 1x amonyum-klorür-potasyum (ACK) tamponunda yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 10-15 dk.
not: 15 dakikadan fazla kuluçkaya yatırmayın. Ticari olarak temin edilebilen ACK tamponu, PBMC fraksiyonunda bulunan artık kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) parçalanmasını sağlamak için kullanılır.
- 40 mL'lik bir hacme kadar PBS ekleyin ve ardından maksimum hızlanma ve yavaşlama ile 500 × g ve 4 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı boşaltarak atın ve adım 1.1.9'u tekrarlayın.
- Süpernatanı atın ve peleti 10 mL tam kültür ortamında (oda sıcaklığında) yeniden süspanse edin.
not: Tam kültür ortamı, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640 hücre kültürü ortamından oluşur.
- CD14 konjuge manyetik boncuklar kullanılarak CD14 +/- hücrelerinin PBMC popülasyonundan manyetik olarak ayrılması
- 10 μL tripan mavisi (% 0.4) çözeltisi ile karıştırılmış 10 μL hücre süspansiyonu kullanarak hücreleri temiz bir hemositometre hücre sayacı ile sayın.
NOT: Tripan mavisi boya toksik bir kimyasaldır ve potansiyel kanserojendir. Temastan kaçınmak için kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilirken kullanılmalı ve atıklar hava geçirmez özel bir toksik atık kabına atılmalıdır. Ölü hücreler mavi görünürken, canlı hücreler mikroskop altında net görünecektir.
- 500 × g'da 7 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve peleti her 1 × 107 hücre için 40 μL'lik bir hacim kullanarak floresanla aktive edilen hücre sıralama tamponunda (FACS) yeniden süspanse edin. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
NOT: FACS tamponu, PBS içinde çözünmüş %2 FBS ve 2 mM etilendiamintetraasetik asitten (EDTA) oluşur.
- 1 × 107 hücre başına 5 μL CD14 mikroboncuk tamponu ekleyin ve bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
- Sığır CD14 + monositlerinin pozitif seçimi için 4-8 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Kuluçka süresi boyunca her 15 dakikada bir girdap.
- İsteğe bağlı adım (akış sitometrisi analizi için): 10 μL CD14-FITC (floresein izotiyosiyanat) boyama antikoru ekleyin ve ardından 4-8 ° C'de 15 dakika inkübasyon yapın. Ayrıntılar için adım 5'teki akış sitometrisi analizine bakın.
- 1 mL FACS tamponu ekleyin ve 500 × g'da 7 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peleti 1 × 108 hücre başına 500 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
- İmmünomanyetik hücre ayırma kolonunu ayırıcıya (manyetik kolon tutucu) yerleştirin ve akışı toplamak için kolon çıkışının altına 15 mL'lik bir toplama tüpü yerleştirin.
- Kolonu 1 mL gazı alınmış FACS tamponu ile yıkayın. Durulamadan sonra kullanılmış 15 mL'lik tüpü yenisiyle değiştirin.
- Bir seferde 500 μL tamponda 1 × 108 hücreyi pipetleyerek hücre süspansiyonunun (adım 1.2.8'den itibaren) kolondan geçmesine izin verin.
not: Hücreleri kolondan geçirmeden önce karıştırırken hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin.
- Kolonu 3x'i her seferinde 3 mL gazı alınmış FACS tamponu ile durulayın.
- Akışı toplayın ve bu ilk ayrıştırılmış fraksiyonu CD14− hücre fraksiyonu (PBMC'ler eksi CD14 + monositler) olarak etiketleyin; bu aynı zamanda naif lenfosit fraksiyonu olarak da adlandırılır.
not: CD14− hücreleri, antijen darbeli MoDC'ler üretilene kadar tam bir kültür ortamında tutulur.
- Sütunu ayırıcıdan çıkarın.
- Atık suyun toplanması için kolonun altına yeni bir steril 15 mL tüp yerleştirin.
- Kolona 5 mL FACS tamponu pipetleyin ve hemen bir piston kullanarak itin.
- Akışı toplayın ve bu ikinci ayrıştırılmış fraksiyonu CD14 + hücre fraksiyonu olarak etiketleyin; buna naif monosit fraksiyonu da denir.
- 1 × 106 hücre / mL elde etmek için hasat edilen CD14 + monositlerine tam kültür ortamı ekleyin.
not: İstenen hücre sayısını elde etmek için gereken tam kültür ortamının hacmini tahmin etmek için ayrıştırılmış CD14 + hücre fraksiyonundaki canlı hücreleri sayın.
- Steril 24 oyuklu bir plaka alın ve her oyuğa 1 mL hücre süspansiyonu (1 × 106 hücre / mL) ekleyin.
- Toplam 5 günlük inkübasyon ile %3 w/v sitokin kokteyli (GM-CSF + IL-4) ilavesiyle CD14+ naif monositlerin naif MoDC'lere farklılaştırılması
- CD14 + monosit içeren her bir kuyucuğu, kitte sağlanan 40 μL (% 3 w / v) sitokin kokteyli ile destekleyin.
- Plakayı% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde ve 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
- 2. günde, her bir kuyucuğun içeriğinin yarısını (500 μL) bir pipet kullanarak ayrı 1,5 mL'lik tüplere aktarın ve 7 dakika boyunca 4 ° C'de 500 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peleti 500 μL taze tam kültür ortamında yeniden süspanse edin.
- Bu hücre süspansiyonunun 500 μL'sini adım 1.3.4'ten belirlenen her kuyucuğa geri aktarın, böylece nihai hacim 1 mL olur.
- Her kuyucuğu 20 μL sitokin kokteyli ile zenginleştirin.
- Kültürü% 5 CO2 ile ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 72 saat inkübe edin.
- 5. gündeki inkübasyondan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın.
NOT: Her kuyucuk, saf MoDC'lerin 1 mL hücre süspansiyonunu içerecektir. MoDC sayısı, kaplanan orijinal monositlerin bir yüzdesi (~%20) olacaktır (1 × 106/mL).
2. Antijen darbeli MoDC'lerin üretilmesi
NOT: Kuduz virüsüne (RV) karşı ticari olarak temin edilebilen ve klinik olarak onaylanmış bir aşı, naif MoDC'lerin olgun antijen sunan MoDC'lere farklılaşmasına neden olabilir. Antijen darbeli MoDC'ler oluşturmak için tek bir RV aşılama dozunun% 0.1'ini (~ 1 μL) kullanın. Ayrıca, saf MoDC'leri oluşturmak için kullanılan aynı kültür plakasında RV darbeli MoDC'lerin üretilmesi tercih edilir, çünkü saf MoDC'lerin yeni bir 24 oyuklu plakaya aktarılması onları olumsuz yönde etkileyecektir.
- 24 oyuklu plakada 1 mL saf MoDC kültürüne 1 μL / mL RV süspansiyonu ekleyin ve% 5 CO2 ve 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
NOT: RV stimülasyonu olmadan kültürlenen saf MoDC'ler arka plan kontrolü olarak (ve sonraki adımlarda lenfositlerle ko-kültür için spesifik olmayan stimülasyon olarak) kullanılır.
- İnkübasyondan sonra, 7. günde, antijen darbeli MoDC'leri içeren 24 oyuklu plakayı 10 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
- Kuyucuk başına 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin. Her birini pipetleyerek iyice karıştırın ve süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Her kuyucukta kalan kalıntı hücreleri toplamak için kuyuları 2 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
- İçeriği ilgili tüplerine aktarın ve hücre süspansiyonunu 7 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın, hücre peletini (antijen darbeli MoDC'ler) tam bir kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hacmi 1 × 105 hücre / mL.
nihai hücre konsantrasyonuna ayarlayın
not: İstenen hücre sayısını elde etmek için gereken ortam hacmini tahmin etmek için canlı hücreleri sayın. MoDC-lenfosit ko-kültür sistemi için 7. günden itibaren RV darbeli MoDC'leri kullanın.
>3. MoDC-lenfosit ko-kültürü
NOT: İn vitro MoDC-lenfosit ko-kültür sistemi, MoDC'lerin antijene özgü lenfositleri hazırlama yeteneğini belirler. 16 günlük ko-kültürden sonra hücrelerin farklı tedavi grupları spesifik, spesifik olmayan ve kontrolü içerir. Spesifik grup, RV darbeli MoDC'lerle birlikte kültürlenmiş lenfositler olarak tanımlanır; spesifik olmayan grup, antijen darbeli olmayan MoDC'lerle birlikte kültürlenmiş lenfositler olarak tanımlanır; kontrol grubu ise MoDC olmadan kültüre edilen lenfositler olarak tanımlanır.
- 2 × 106 hücre / mL'lik bir hücre konsantrasyonu elde etmek için ayrıştırılmış naif lenfosit fraksiyonuna (CD14-hücreleri) tam kültür ortamı ekleyin.
NOT: İstenen hücre sayısını elde etmek için gereken ortam hacmini tahmin etmek için, toplanmalarından bu yana 24 oyuklu bir plakada tam kültür ortamında tutulan CD14-hücre kültüründeki canlı hücreleri sayın.
- 7. günde, steril 24 oyuklu bir plaka alın ve kuyucukları 1 mL saf lenfosit hücre süspansiyonu (2 × 106 hücre / mL) artı 1 mL antijen darbeli veya antijen darbeli olmayan MoDC süspansiyonu (1 × 105 hücre / mL) ile tohumlayın.
not: Her bir oyuktaki toplam hacim, kuyucuk başına lenfositlere 1:20 MoDC oranı ile 2 mL olacaktır.
- Plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 48 saat inkübe edin.
- Antijen darbeli MoDC'lerle kültür zenginleştirme ve yeniden uyarma
- Antijen darbeli MoDC-lenfosit ko-kültürünün inkübasyonundan sonra, 9. günde, her bir kuyucuğu 20 ng / mL rekombinant IL-2 ile destekleyin ve 120 saat daha (5 günlük inkübasyon) inkübe etmeye devam edin.
- 14. günde, 1 mL ko-kültürü steril 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 7 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL antijen darbeli veya darbesiz MoDC (1 × 105 hücre / mL) ile yeniden süspanse edin. Pipetleyerek nazikçe karıştırın ve hücre süspansiyonlarını belirlenen kuyucuklarına geri aktarın.
not: Bu adımda, her bir oyuktaki toplam hacim 2 mL'dir.
- % 5 CO2 ve 37 ° C'de 48 saat inkübasyona devam edin. 16. günde inkübasyondan sonra, ko-kültür akış sitometrisi, qPCR ve ELISA.
kullanılarak analiz için hazırdır
not: MoDC-lenfosit ko-kültürünün her bir oyuğundaki her 2 mL için, akış sitometrisi için 1 mL yeniden süspanse hücre boyanır, RNA ekstraksiyonu için 1 mL kullanılır ve her ikisinden de süpernatanlar ELISA için kullanılır.
4. Akış sitometrik analizi
NOT: Numuneleri bir akış sitometresinde çalıştırmadan önce hücreleri uygun işaretleyiciler/mAb ile boyayın. Akış sitometrisi analizi için kullanılan reaktifler (boyama mAb ve izotip kontrolleri), kit, alet ve yazılım hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
- Akış sitometresi boyama protokolü
not: Anti-CD14 mAb kullanarak PBMC'ler ve saf lenfositler ve monositler için hücre yüzeyi boyama yapın (adım 1.2.6). Naif MoDC'lerin hücre yüzeyi boyaması için anti-CD86'ya özgü, anti-CD40'a özgü ve anti-MHC II'ye özgü mAb kullanın. 16. gün ko-kültürlerinden itibaren hücrelerin hücre yüzeyi boyaması için anti-CD4, anti-CD8 ve anti-CD25 mAbs kullanın; hücre içi boyama için anti-Ki-67 mAb kullanın. Ayrıca, hücreleri negatif izotip kontrol mAb ile veya mAb olmadan boyayın (FMO: floresan eksi bir). Yüzey ve hücre içi belirteçler için boyama sırasındaki temel fark, hücre yüzeyi belirteçleri için, hücrelerin canlı/ölü (L/D) boyama veya diğer işlemlerden önce belirli yüzey mAb ile boyanması gerektiğidir. Bununla birlikte, hücre içi boyama, L / D boyamadan sonra yapılır ve hücre içi penetrasyona izin vermek için bir fiksasyon artı geçirgenleştirme adımı gerektirir.
- 1 mL hücre süspansiyonunu bir pipet kullanarak steril 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 500 × g.
'de 10 dakika santrifüjleyin
NOT: Santrifüjlemeden sonra, MoDC-lenfosit ko-kültüründen hücreleri işlerken, süpernatanı ELISA analizi için saklayın.
- Peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Artık hücreleri 1 mL PBS kullanarak toplayın ve bunu yeniden süspanse edilmiş pelet ile birleştirin.
- Hücreleri içeren 15 mL'lik tüpe 10 mL PBS ekleyin, pipetleyerek karıştırın ve 850 x g'da 7 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve adım 4.1.3'ü tekrarlayın.
- Süpernatanı atın ve süpernatanı boşalttıktan sonra kalan kalan süspansiyon (yaklaşık 180 μL) ile hücre peletini dikkatlice yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu v tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve dökülmeyi önlemek için kuyuları kapatın.
- Plakayı 1.400 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, sıvı kuyularını boşaltmak için plakayı bir atık kabının üzerine itin ve fazla sıvının çıkarılmasını sağlamak için plakayı emici kağıda hafifçe vurun.
- Oyuk başına 25 μL yüzey boyama ana karışımı ekleyin ve bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın, ardından 4 ° C'de 30 dakika
inkübe edin
not: Yüzey boyama ana karışımını tek bir kuyucuk için hazırlamak için, 20 μL FACS tamponuna 2,5 μL yüzey mAb ekleyin.
- Kuyucuk başına 200 μL FACS tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, sıvı kuyularını boşaltarak boşaltın ve fazla sıvıyı çıkarmak için plakayı emici kağıda vurun.
- Kuyucuk başına 100 μL L / D boyama çözeltisi ekleyin. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın, ardından karanlıkta 15 dakika boyunca 4 °C'de inkübe edin.
not: Tek bir kuyucuk için, 0.25 μL L / D boyayı 100 μL FACS tamponunda çözün. L / D boyası, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmeye yardımcı olur.
- 100 μL FACS tamponu ekleyin. Kuyuları kapakla kapatın ve plakayı 5 dakika boyunca 1.400 × g santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda hafifçe vurun.
- Adım 4.1.11'i tekrarlayın.
- Kuyucuk başına 50 μL fiksasyon solüsyonu ekleyin (kit ile birlikte verilir) ve plakayı oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe etmeden önce bir pipetle karıştırın.
- Kit ile birlikte verilen 1x geçirgenleştirme-yıkama tamponundan (PW) 150 μL ekleyin ve kuyucukları kapakla kapatın.
not: 10 mL 1x PW tamponu hazırlamak için, 1 mL 10x perma tamponunu 10 mL dH2O ile seyreltin.
- Plakayı 1.400 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltarak ve plakayı emici kağıda vurarak atın.
- 200 μL 1x PW ekleyin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüjleme yapın. Süpernatanı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda hafifçe vurun.
- Hücre içi boyama için, oyuk başına 25 μL hücre içi boyama ana karışımı (anti-insan Ki-67 mAb) ekleyin. İyice karıştırın ve plakayı 4 ° C'de veya karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
not: Hücre içi boyama ana karışımını tek bir kuyucuk için hazırlamak için, 24 μL 1x PW'ye 1 μL Ki-67 mAb ekleyin. Hücre içi boyama belirteci, yalnızca 16. gün ko-kültüründen hücreleri işlerken kullanılır. PBMC'ler, naif lenfositler, monositler ve naif MoDC'ler işlenirken hücre içi boyama yapılmaz.
- İnkübasyonun ardından, her oyuğa 200 μL 1x PW ekleyin. Bir pipet ile karıştırın ve 1.400 g × 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda hafifçe vurun.
- 200 μL FACS tamponu ekleyin, ardından 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda hafifçe vurun.
- Hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve her bir oyuğun içeriğini ayrı steril akış sitometresi tüplerine aktarın. Artık hücreleri toplamak için oyuk başına 300 μL FACS tamponu kullanın. Hücreler artık akış sitometrisi analizi için hazırdır.
- Numunenin bir akış sitometresi üzerinde çalıştırılması
not: Numuneler, üreticinin el kitabına göre bir akış sitometresinde (488 nm, 638 nm ve 405 nm lazerler kullanılarak) çalıştırıldı. Protokolün ayrıntıları, sorun giderme ve özelleştirmesi için kılavuza bakın.
- Numuneleri okumadan önce ve sonra rutin temizlik prosedürlerini gerçekleştirin.
not: Tüpleri cihaza yüklerken bir konumu atlamayın.
- Temizleme döngüsü için, akış temizleme reaktifi içeren ilk tüp ve dH2O içeren kalan üç tüp ile toplam dört tüp kullanın; her tüp 3 mL'ye sahip olacaktır. Temizleme çalışması sırasında, yan saçılma (SSC) için 265 V'a karşı ileri saçılma (FSC) için 330 V altında tüp başına 100.000 olay yakalayarak yaklaşık 1 dakika boyunca orta akış hızına sahip veriler elde edin.
not: Temizlik sırasında herhangi bir kalıntı veya hücresel olay bildirilmemelidir; Böyle bir durumda, temizleme adımını yeniden gerçekleştirin. Numuneleri çalıştırmak için, verileri almadan önce tüm numunelerin homojen bir süspansiyonda olduğundan emin olun çünkü bu, doğru bir okuma sağlar.
- Sitometreyi bağlamak ve açmak için, başlık çubuğunun sol köşesinde bulunan Uygulama Düğmesine tıklayın. Uygulama açılır menüsünden Sitometri seçeneğini seçin ve Power On.
not: Uygulama açılır menüsünden, Aç seçeneği kullanıcıların önceden programlanmış tahlillere göz atmasına izin verirken, Yeni Protokol seçeneği kullanıcıların yeni protokoller oluşturmasına olanak tanır.
- Başlangıçta negatif kontrol örneğini çok tüplü tutucuya yükleyin. Yeni Protokol'ü seçin ve çalışma alanının/ekranın sol tarafındaki iş listesine bakın.
- Çalışma listesinde, numunenin çok tüplü tutucudaki konumunu tanımlayın ve tanımlama için numuneye ve protokole bir isim verin.
- Çalışma alanının sol tarafında bulunan Donanım Panelinden dedektörler (FSC, SSC ve 10 floresan aralığı), fotoçoğaltıcıların voltajları (V) ve kazançları ve sinyalin alan-yükseklik-genişliği (AHW) gibi birden çok parametreyi ayarlayın ve seçin.
not: Dedektörler için aşağıdaki ayarlar, deney ve kullanılan alete göre seçilmiştir: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dekstran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
- Başlık çubuğunun altında bulunan Cihaz Edinme Kontrol Panelinden akış hızı (orta), Zaman (5 dk) ve algılanması istenen Olaylar (bkz. adım 5.2.8) seçeneklerini ayarlayın. Enstrümanın örneği çizmesine/çalıştırmasına ve algılanan olayların gerçek zamanlı önizlemesini göstermesine izin vermek için Tek Al seçeneğine tıklayın.
- Gerçek zamanlı önizlemeden, floresan eşiğini (voltaj ve kazanç) ve hücre boyutunu, herhangi bir hücresel kalıntıyı hariç tutarken istenen hücre popülasyonunun etrafına kapılar çizecek şekilde ayarlayın.
not: FSC, hücreleri boyutlarına göre ayırt etmeye yardımcı olur, böylece kullanıcıların monositler ve lenfositler gibi bağışıklık sistemi hücreleri arasında ayrım yapmasına olanak tanır; monositler lenfositlere kıyasla daha büyüktür ve daha yüksek FSC yoğunluğu gösterir.
- Yaklaşık toplam 5.000 canlı MoDC, 50.000 canlı lenfosit ve 50.000 canlı monosit olayı elde edin.
- Tüm parametreler negatif kontrol örneğine göre ayarlandıktan sonra, Durdur'a tıklayın ve protokolü kaydedin.
- Şimdi tüm numuneleri çok tüplü yükleyiciye yükleyin. Çalışma listesindeki her bir numuneyi tanımlayın ve negatif kontrole göre ayarlanan parametreleri deney içindeki tüm numunelere uygulayın. Deneydeki tüm örneklerin art arda çalıştırılmasına izin vermek için Al seçeneğine tıklayın.
- Tüm örneklerden elde edilen veriler elde edildikten sonra, sıralı bi-parametrik ve mono-parametrik histogramların oluşturulmasına izin veren uygun bir veri analizi yazılımı kullanarak kaydedin ve okunabilir verilere dönüştürün.
