Hemositin hematopoietik ceplere yeniden yapışmasını değerlendirmek için bir Hemosit bozukluğu testi

Özet

Kaynak: Petraki, S. et al., Drosophila melanogaster Larvasının Kan Hücresi Popülasyonlarının Tahlilleri.J. Vis. Uzm.(2015)

Bu video, Drosophila larvalarının hematopoetik ceplerinde hemosit yeniden yapışmasını değerlendiren hemosit bozukluğu testini göstermektedir. Mekanik bozukluk, yerleşik hemositleri serbest bırakarak dolaşımdaki hemosit sayısını yükseltir. İyileşme sonrası, yerleşik hemositlerin yeniden yapışması doğrulanır ve bu da geri dönüşümlülüğü gösterir.

Protokol

1. Hemosit Kanaması/Kazıma Testi

1. Slaytların hazırlanması:
   1. Karo tarama fonksiyonu olmayan mikroskoplar için Seçenek 1: Analiz edilecek her larva için, mikroskobun alan görüntüleme alanına karşılık gelen, her biri 2 mm kareden oluşan yaklaşık 5 Pap-pen kuyusu olan bir cam slayt hazırlayın; her birine yaklaşık 5 - 10 μl S2 ortamı ekleyin (Şekil 1A). Kuyuların kurumasını önlemek için slaytları nemli bir odada tutun.
   2. Karo tarama işlevine sahip mikroskoplar için Seçenek 2: Analiz edilecek her larva için, her biri ~ 3 - 4 mm karelik 3 ila 4 Pap-pen oyuğu olan bir cam slayt hazırlayın; her oyuğa yaklaşık 15 - 20 μl S2 ortamı ekleyin (Şekil 1B). Kuyuların kurumasını önlemek için slaytları nemli bir odada tutun.
      not: Yukarıda önerilen kuyucuk sayısı, larva başına toplam 3.000 hemosit için yeterlidir (geç 2^{. instar} larvaları, ~ 2.5 - 3 mm uzunluk, larva kan hücrelerinin çoğunu transgen olarak etiketler). Daha büyük kan hücresi sayılarını değerlendirirken, aşırı kalabalıklaşmayı önlemek için daha fazla kuyuya ihtiyaç duyulabilir.
2. Larvaların toplanması:
   1. Larva içeren bir sinek şişesine su püskürtün ve larvaları bir Petri kabına yıkayın veya larva içeren bazı yiyecekleri bir Petri kabına alın ve bir fışkırtma şişesi kullanarak suyla seyreltin.
   2. Larvaları bir boya fırçası kullanarak Petri kabından nazikçe toplayın ve bunları bir boşluk kabındaki suya veya soğuk bir blok üzerindeki bir slayta yerleştirin.
      not: Larvalar sınırlı bir süre için suda veya soğuk bir blokta tutulabilir; Larva ölümünü veya hemositler üzerinde istenmeyen etkileri önlemek için örnekleri 45 dakika veya daha kısa sürede kullanın.
3. Diseksiyonu:
   1. Soğuk bir metal blok üzerinde floresan mikroskobu altında larvaları seçin. İstenirse boyutları ve görüntü larvalarını ölçün.
   2. Dolaşımdaki hemositlerin izolasyonu ("Kanama"):
      1. Larvalar seçildikten sonra, ilk Pap-pen kuyucuğuna bir larva yerleştirin (Şekil 1C, 2A).
      2. Larvaların hem arka hem de ön uçlarında bir kesi yapmak için 2 temiz iğne veya diseksiyon makası ve forseps kullanın. Yerleşik hemositleri rahatsız etmekten kaçınmak için, bu kesileri larvaların ventral tarafında yapmak en iyisidir. Tutarlı sonuçlar için, kesileri her larva için aynı yerlerde yapın. 1. instar larvalar için 1 insizyon (ventral anteriorda) yeterlidir.
      3. Larvaların herhangi bir baskı veya fiziksel çalkalama olmadan birkaç saniye kanamasına izin verin (Şekil 2A).
         not: Birden fazla larva üzerinde çalışıyorsanız, larvaları buzda çok uzun süre tutmaktan kaçınmak için bir sonraki adıma geçmeden önce her biri için bu kesileri yapmak daha iyidir, bu da numunelerin bütünlüğünü etkileyebilir.
      4. Larvaları iğneler veya forseps ile nazikçe kaldırın ve kalan dolaşımdaki hemositleri durulamak için ikinci kuyuya daldırın. Bundan sonra, yerleşik hemositlerin salınmasını takip edin.
   3. Yerleşik hemositlerin izolasyonu ("Kazıma"):
      1. Larvaları yavaşça bir sonraki kuyucuğa aktarın (Şekil 2C).
      2. Tipik olarak larvanın ön ucundan yaklaşık 1/3 oranında bulunan ve larva vücut duvarından dorsal olarak floresan yayabilen larva lenf bezini tanımlayın. Delinmeyi önlemek için larvaları lenf bezine mümkün olduğunca yakın bir iğne ile sıkıştırarak yerleşik hemositleri serbest bırakırken lenf bezinden kaçının (Şekil 2C).
         not: Normal gelişim sırasında, lenf bezi hemositlerinin olgunlaşması larva hemositlerine göre gecikir ve farklılaşmış hemositlerin floresan raportörleri genç larvaların lenf bezlerinde bir sinyal göstermeyebilir. Bu durumlarda, farklılaşmış floresan işaretli larva hemositlerinin lenf bezi hemositleri tarafından kontaminasyonu beklenmediğinden lenf bezine daha az dikkat edilmesi gerekir.
      3. Kazıma ve / veya iğneleme diseksiyon işleminde yerleşik kan hücrelerini serbest bırakın. Larvaları lenf bezinin yakınında (yukarıya bakın) veya gerektiğinde diğer vücut bölgelerini etkili bir şekilde sabitlemek için bir iğne ucu kullanın. Larva vücut duvarından görülebilen hemosit kümelerine başka bir iğne ile vurun (Şekil 2C, E), hemositleri ayırmak amacıyla. Hemositler ayrıca bir kazıma hareketiyle de serbest bırakılabilir. Bununla birlikte, epidermisin erken yırtılması, büyük kan hücresi kümelerini serbest bırakabilir ve bu da otomatik sayımı daha zor hale getirebilir.
         not: Larvaların yaşına ve genotipine bağlı olarak, toplam hemosit sayısı değişecektir. Tek hücreli görüntü analizini daha zor hale getirebilecek bazı kuyucukların kan hücreleriyle aşırı kalabalıklaşmasını önlemek için yukarıda açıklanan serbest bırakma işlemini birkaç kuyuya dağıtın.
      4. Son karkasta az sayıda hemosit kalırsa, bu hemositleri mikroskopta gözlemleyerek ve manuel bir çetele sayacı kullanarak sayın (Şekil 2E). Saymayı kolaylaştırmak için, karkası aynı sürgünün temiz bir alanına yerleştirin ve optik düzlemlerin sayısını azaltmak için mümkün olduğunca ince bir şekilde yayın.
      5. Diseksiyon tamamlandıktan sonra, kuyucukları görüntülemeden önce hücrelerin yerleşmesi için 5 - 10 dakika bekleyin (ancak mutlaka yapışması gerekmez). Kurumasını önlemek için slaytı nemli bir odada inkübe edin ve çöken hemositleri rahatsız edebilecek slaytların kaba kullanımından kaçının.
         not: Hemosit sayıları belirlenirken, salınan hücreler sabitlenmez ve hücreler diseksiyondan kısa bir süre sonra, tercihen larvadan salındıktan sonraki 30 dakika içinde görüntülenmelidir. Ortamın hacmine ve hücre özelliklerine bağlı olarak, hücrelerin büyük çoğunluğu 5-10 dakika içinde yerleşmiş olacaktır, bu da kuyudaki ortamın optik düzlemlerine odaklanarak doğrulanmalıdır. Bununla birlikte, bu zamana kadar kan hücrelerinin sadece bir kısmı kayma yüzeyine yapışmış olacaktır, bu da hücre fiksasyonuna dayalı yaklaşımlar için bu protokolün değiştirilmesi durumunda dikkate alınması gereken bir gerçektir.
4. Miktar:
   1. Floresan mikroskop altında yerleşmiş hemositlerin görüntülerini alın (Şekil 2B, D, F). ImageJ yazılımını kullanarak hemositlerin miktar tayinini takip edin.
   2. Görüntüyü ImageJ hücre sayma algoritması için hazırlayın:
      1. ImageJ'yi kullanarak kuyu görüntüsünü açın: Dosya → → açın (dosyayı bulun ve seçin).
      2. Görüntülerin 8 bit veya 16 bit olduğundan emin olun. Görüntü'yü seçerek görüntünün eşiğini ayarlayın, ardından Ayarla'yı tıklayın ve Eşik'i seçin. "Eşik penceresi"ne bakın (Şekil 3A).
      3. "Koyu Arka Plan" seçeneğini işaretleyin. "Kırmızı"yı seçin ve görüntüdeki her hücre kırmızı bir nokta ile işaretlenene kadar Alt Eşik Düzeyini artırın (siyah oka bakın) (kapatılmayan hücreler gri tonlamalı olarak görülecektir; Şekil 3B). Alt Eşik arttıkça, bazı hücreler işaretlenmemiş hale gelecektir. Bu, Alt Eşiğin ne kadar ayarlanacağının göstergesi olabilir.
         not: Bazen hücre kümeleri çözülemez ve parçacık sayacı tarafından bir olarak sayılır. Bu gibi durumlarda, bir kümedeki hücre sayısı, görüntüyü inceleyerek (gerekirse yakınlaştırarak) ve bir çetele sayacı kullanılarak manuel sayım yoluyla tahmin edilebilir. Alternatif olarak, hücre kümelerini çözmek için Alt Eşik artırılabilir; Bu manipülasyondan kaynaklanan işaretlenmemiş hücreler daha sonra bir çetele sayacı kullanılarak sayılabilir.
   3. ImageJ kullanarak hücre numarasını analiz edin:
      1. Hücreleri saymak için Partikül Analiz Cihazını başlatın (Şekil 3C). Analiz Et'i seçin ve Parçacığı Analiz Et'e tıklayın. İsteğe bağlı olarak, algoritmanın saydığı parçacıkları görmek için "Kaplama Anahatları"nı seçin (Şekil 3D). Alternatif olarak, algoritmanın sayması için bir birimin (ör. hücre, hücre kümesi vb.) boyutuna veya piksel alanına bir sınır belirleyin.
      2. Tamam'a tıklayın. Sayımla birlikte bir özet penceresine bakın (Şekil 3E).

2. Hemosit Bozukluğu Testi

1. Hemositleri rahatsız etmek için larvaları seçin ve yaklaşık 0.5 g cam boncuk (212 - 600 μm) içeren 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 0.5 ml su ekleyin.
2. Tüpü elle 10 hızında 1 dakika boyunca girdaplayın.
3. Mikrosantrifüj tüpünün içeriğini bir Petri kabına dökerek ve larvaları bir boya fırçası ile seçerek larvaları cam boncuklardan alın.
4. İyileşme aşaması için, larvaları az miktarda sinek yemi ile önceden hazırlanmış Petri kaplarına yerleştirin. Larvaların hemosit paternlerini 45 dakikalık bir süre boyunca veya istenildiği gibi yeniden oluşturmalarına izin verin.
   not: Bu süreçte öldükleri için hareket etmeyi bırakan larvaları atın. Bununla birlikte, genellikle 1 dakikalık girdaplaşmadan sonra çok az hasar görürüz.
5. İyileşme döneminden sonra, yukarıda Bölüm 1'de açıklandığı gibi Kanama / Kazıma Testi ile devam edin.

Sonuçlar

Şekil 1. Hemosit Kanama / Kazıma ve Rahatsızlık Testi kurulumu ve şeması. (Bir)Tek Görüntü Slayt Kurulumu: 5X objektifle görüntüleme için beş adet 2 mm kare. (B) Döşeme Tarama Slayt Kurulumu: ≤2,5 mm'lik larvaların kanama/sıyrıklarını bir karo tarama mikroskobu ile görüntülemek için dört adet 3 mm'lik kare. Görüntüleme için önerilen hedefler 5X veya 10X'tir. (C) Kanam...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
6cm/9cm Petri kapları			Değerlendirilecek her genotip için bir tane
Su fışkırtma şişesi
Metal kaşık/spatula
İnce boya fırçası			örneğin bir "astar"
Cam boşluklu çanak
PAP kalemi: Süper PAP PEN IM3580	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.
Cam slaytlar			Her slaytın üzerine 5 veya daha fazla PAP PEN karesi çizilecektir. Karelerin boyutu, mikroskop kamerasının görüntüleme amacına ve büyütme yeteneğine bağlıdır; örneğin 2 mm kareler.
Nemli oda			Bu, slaytların ve kuyuların kurumasını önlemek için kullanılacaktır: yanları/tabanı astarlayan ıslak kağıt havlularla kapalı kap
Schneider'in Drosophila hücre kültürü ortamı	Canlandırıcı
Soğuk blok			Bu, buz içeren bir kovada soğutulmuş metal bir bloktur (diğer bir deyişle ısıtma bloğu); tercihen siyah renkli veya başka bir koyu, yansıtıcı olmayan renk
İğneli iki adet 1 ml şırınga (27G 1/2)	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.		Diseksiyonlar için.
İsteğe bağlı: Cerrahi yaylı makas (kesme kenarı 2 mm)	Güzel Bilim Araçları
Cam boncuklar, 212-600 mikron	Sigma
2 ml Eppendorf tüpleri	Eppendorf Belediyesi		Her genotip değerlendirmesi için bir tane
Vorteks Karıştırıcı	Balıkçı Bilimsel
Floresan işaretli hemositlere sahip transgenik Drosophila larvaları. Uygun transgenler şunları içerir: HmlΔ-DsRed (Makhijani ve diğerleri, 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi ve diğerleri, 2009), BcF6-CFP ve -GFP (Gajewski ve diğerleri, 2007) veya HmlΔ-GAL4 (Sinenko ve Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer ve diğerleri, 2005), He-GAL4 (Zettervall ve diğerleri, 2004), Crq-GAL4 (H. Agaisse (Stramer ve diğerleri, 2005)) veya eater-GAL4 (Tokusumi ve diğerleri, 2009) UAS-GFP veya diğer floresan protein transgenleri ile birlikte.
Floresan diseksiyon mikroskobu	Leica Belediyesi		Burada: Leica M205, isteğe bağlı kamera, görüntüleme yazılımı ve ölçüm modülü ile
Kamera eki ile ters floresan mikroskobu	Leica veya Keyence		Döşeme tarama işlevi olsun veya olmasın (örn. Leica DMI serisi, Keyence BIOREVO BZ-9000 serisi)