SIV'e Özgü CD8+ Bellek T Hücrelerini Analiz Etmek için Bir Peptit-MHC-I Tetramer Boyama Tekniği

Özet

Kaynak: Gonzalez-Nieto, L., et al. Rhesus Macaques'te Simian İmmün Yetmezlik Virüsüne Özgü CD8⁺ T Hücrelerinin Peptit-MHC-I Tetramer Boyama ile Analizi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, peptit majör histouyumluluk kompleksi sınıf I (pMHC-I) tetramerleri kullanılarak simian immün yetmezlik virüsüne (SIV) özgü ^CD8+ bellek T hücrelerinin karakterize edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Bir pMHC-I tetrameri, SIV'e özgü peptitlere bağlı ve bir florofora konjuge edilmiş dört MHC-I molekülünden oluşan bir komplekstir. Bu tetramerler, SIV'e özgü CD8 ⁺ T hücreleri üzerindeki T hücresi reseptörlerine (TCR'ler) seçici olarak bağlanır ve bu hücrelerin karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Protokol

1. PKI Tedavisi

>NOT: Bu isteğe bağlıdır, ancak Mamu-B*017:01 tetramerler için önerilir.

1. PBMC'yi R10 ortamında 1.6 x 10⁷ hücre / ml konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
2. Bu hücre süspansiyonunun 50 μl'sini karşılık gelen akış sitometri tüplerine ekleyin. Her tüpe 50 μl 100 nM PKI çözeltisi ekleyin.
3. Her tüpü girdaplayın. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Bu adımın sonunda, her tüp 8.0 x 10⁵ PBMC ve 50 nM PKI içeren 100 μl'lik bir hücre süspansiyonuna sahip olmalıdır.
4. pMHC-I tetramer boyama adımına geçin.

2. Florokrom etiketli pMHC-I Tetramerleri ile boyama

1. pMHC-I tetramer ana karışımını hazırlamadan önce, pMHC-I tetramer tüplerini 20.000 x g'da 4 °C'de en az 15 dakika santrifüjleyin. Bu adımın amacı, arka plan boyamasını artırabilecek pMHC-I tetramer çözeltisindeki protein agregatlarını peletlemektir. Santrifüjleme adımı tamamlandıktan sonra, protein agregatlarının birikeceği tüpün altından pipetleme yapmaktan kaçının.
2. Tüm deney tüplerini lekelemek için yeterli pMHC-I tetramer ana karışımı hazırlayın. Pipetleme hatalarını hesaba katmak için bu ana karışımın toplam hacminin %15'inden fazlasını hazırlayın.
3. pMHC-I tetramerlerini leke tamponunda (örneğin, Brilliant Stain Buffer) seyreltin, böylece her teste 25 μl pMHC-I tetramer ana karışımı eklenir.
   1. PBMC'yi test başına iki pMHC-I tetramer ile etiketleyin; biri allofikosiyanin (APC) ve diğeri Brilliant Violet (BV) 421'e konjuge edilmiştir.
4. 8.0 μl'lik bir nihai hacimde karşılık gelen akış sitometri tüplerine 5 x 100^PBMC ekleyin. Hücreler yukarıda tarif edilen PKI işlemine tabi tutulmuşsa, bu adımda zaten 100 μl'de yeniden süspanse edilmeleri gerekir.
5. İlgili akış sitometri tüplerine 25 μl pMHC-I tetramer ana karışımı ekleyin. Bu adımın sonunda, her tüpteki son hacim 125 μl olmalıdır.
6. Hücre süspansiyonunu homojenize etmek için her tüpü vorteksleyin.
7. Karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Bu 45 dakikalık inkübasyon sırasında yüzey boyama monoklonal antikor (mAb) kokteylini hazırlayın.

3. Yüzey Boyama

1. Tüm deney tüplerini lekelemek için yeterli mAb ana karışımı hazırlayın. Pipetleme hatalarını hesaba katmak için bu ana karışımın toplam hacminin %15'inden fazlasını hazırlayın.
2. Leke tamponu ile ana karışımın hacmini, test başına 50 μl eklenecek şekilde ayarlayın.
3. CD8 ⁺ olmayan T hücrelerinin uygun şekilde dışlanması ve bellek alt kümelerinin tanımlanması için, yüzey boyama ana karışımında aşağıdaki moleküllere karşı yönlendirilmiş titre edilmiş miktarlarda mAb kullanın.
   not: Her bir mAb'ye konjuge edilen florokromlar referans olarak verilmiştir: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 ve CCR7 FITC. CD14, CD16 ve CD20'ye karşı mAb'lerin, "boşaltma" kapısına dahil edilecekleri için aynı florokromla (yani BV 510) konjuge edildiğini unutmayın.
4. Yüzey boyama ana karışımında ölü hücreleri ayırt etmek için sabitlenebilir bir boya ekleyin [yani, amin reaktif boya (ARD)]. ARD reaktifinin, "boşaltma" kapısında kullanılanlara benzer bir emisyon spektrumuna sahip bir florokrom ile konjuge edildiğinden emin olun. Bu durumda, ARD Aqua'yı kullanın.
5. 3.1-3.4'te tarif edilen boyama ana karışımından 50 μl'yi karşılık gelen akış sitometri tüplerine ekleyin. Bu adımın sonunda, her tüpteki nihai hacim 175 μl olmalıdır.
6. Her tüpü girdaplayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 25 dakika inkübe edin.
7. Hücreleri yıkama tamponu ile yıkayın (% 0.1 sığır serum albümini ve% 0.45 g / L NaN3 içeren fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi).
   Dikkat: Sodyum azid (_NaN3) toksik bir maddedir. Çok küçük miktarlara bile maruz kalmak semptomlara neden olabilir. Bu maddeyi, bu deneylerin yapıldığı kurumdaki Çevre Sağlığı ve Güvenliği (EHS) Ofisi tarafından belirtilen yönergelere göre kullanın.
8. Tüpleri 510 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice ayrı bir atık kabına boşaltın. Peleti rahatsız etmediğinizden emin olun.
   Dikkat: Yıkama tamponunda bulunan sodyum azid ile reaksiyona girebileceği ve toksik bir gaz oluşumuna neden olabileceği için yıkama tamponu süpernatanını ağartıcı içeren rezervuarlara boşaltmayın. Sodyum azidin nasıl atılacağına ilişkin yönergeler için bu deneylerin yapıldığı kurumdaki EHS Ofisi ile iletişime geçin.
9. Boşalttıktan sonra, her tüpte tutulan artık sıvıdaki hücreleri girdaplayın.

>4. Hücre Fiksasyonu

1. Hücreleri sabitlemek için tüm tüplere 250 μl %2'lik bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi ekleyin.
   DİKKAT: PFA toksik bir maddedir. Çok küçük miktarlara bile maruz kalmak semptomlara neden olabilir. Bu maddeyi, bu deneylerin yapıldığı kurumdaki EHS Ofisi tarafından belirtilen yönergelere göre kullanın.
   1. % 2'lik PFA çözeltisinin hücreler için izotonik olması gerektiğinden, bu çözeltiyi hazırlamak için PBS kullanın. Birden fazla deney için yüz mililitre% 2'lik bir PFA çözeltisi yeterlidir. Hücre agregatlarının oluşumunu önlemek için% 2 PFA ilavesinden hemen sonra tüm tüpleri iyice vorteksleyin.
2. Karanlıkta 4 °C'de 20 dakika inkübe edin.
3. 3.7-3.9 adımlarını tekrarlayarak hücreleri yıkayın. Bu adım tamamlandıktan sonra, hücreler karanlıkta 4 °C'de 24-48 saat saklanabilir. Geçirgenleştirme aşamasına geçmeden önce tüpleri iyice girdaplayın.

>5. Hücrelerin Geçirgenliği

1. 500 μl geçirgenlik tamponu ekleyin. Tüm tüpleri girdaplayın.
2. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
3. 3.7-3.9 adımlarını tekrarlayarak hücreleri yıkayın.

6. Hücre İçi Lekelenme

1. Tüm deney tüplerini lekelemek için yeterli mAb ana karışımı hazırlayın.
2. Hacmi PBS veya leke tamponu ile ayarlayın, böylece test başına 50 μl hücre içi mAb ana karışımı eklenir.
3. 6.1 ve 6.2'de açıklanan mAb ana karışımını, CD3 ve granzim B'ye (Gzm B) yönelik titre edilmiş miktarlarda mAb kullanarak hazırlayın.
   not: pMHC-I tetramerleri tarafından TCR katılımı, CD3 içselleştirmesine neden olabilir, bu da yüzey boyama ana karışımına anti-CD3 mAb eklenirse tetramer + CD3 ⁺ CD8 ⁺ T hücrelerinin tespitine müdahale edebilir. Bunu önlemek için, bu aşamada, yani hücreler geçirgenleştikten sonra anti-CD3 mAb'yi ekleyin. Her mAb'ye konjuge edilen florokromlar referans olarak listelenmiştir: CD3 PerCP Cy5.5 ve Gzm B PE.
4. İlgili tüplere 50 μl mAb kokteyli ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
5. 3.7-3.9 adımlarını tekrarlayarak hücreleri yıkayın. Tüpler bir akış sitometresinde alınmaya hazırdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dasatinib Belediyesi	Akson medchem	Akson 1392	DMSO'da yeniden askıya alınmalı ve hemen -20 ° C'de saklanmalıdır
Glutamax ile RPMI	gibco/ Yaşam Teknolojileri	61870-036	4 °C'de saklanmalıdır
Isı Etkisiz Hale Getirilmiş FBS	gibco/ Yaşam Teknolojileri	10082-147	4 °C'de saklanmalıdır
Penisilin-Streptomisinp-Amfoterisin B	Fransa	17-745D	4 °C'de saklanmalıdır
DMSO, Susuz	Yaşam Teknolojileri	D12345	Oda sıcaklığında saklayın.
5 mL Yuvarlak Tabanlı Polipropilen Tüpler	VWR (VWR)	60819-728
Florokrom konjuge pMHC-I tetramerleri	NIH Tetramer Çekirdeği veya MBL, Inc.		4 °C'de saklanmalı ve muhafaza edilmelidir. Kullanmadan önce 15 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin. Dondurmayın.
Florokrom konjuge mAbs	Çeşitli şirketler		4 °C'de saklanmalı ve muhafaza edilmelidir. Dondurmayın.
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti	Yaşam Teknolojileri	L34957	-20 °C'de saklanmalıdır. Kullanmadan önce her bir alikotu 50 μL DMSO'da yeniden süspanse edin.
Parlak Leke Tamponu	BD Biyolojik Bilimler	563794	4 °C'de saklanmalıdır
Fosfat Tamponlu Tuzlu	VWR (VWR)	97064-158	Oda sıcaklığında saklayın
Albümin Sığır	VWR (VWR)	700011-230	4 °C'de saklanmalıdır
Sodyum Azid	VWR (VWR)	97064-646	Oda sıcaklığında saklayın. Toksik madde. Çamaşır suyu ile karıştırmayın.
çamaşır suyu	VWR (VWR)	89501-620	Aşındırıcı kimyasal, sodyum azid ile karıştırılamaz. Dikkatli tutun
Paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15714-S	Yanıcı, aşındırıcı ve toksik reaktif. Dikkatli tutun
Polisorbat 20 (Ara-20)	Alfa Aesar	L15029	Oda sıcaklığında saklayın
Geçirgenlik Çözümü 2	BD Biyolojik Bilimler	340973	Toksik ve aşındırıcı reaktif. Dikkatli tutun
Sarsdet Tüpler 1.5 mL vidalı üst	VWR (VWR)	72.692.005
2.0ml DNA / RNA Düşük Bağlama Tüpleri	Eppendorf Belediyesi	22431048	Steril mikrotüp kullanımı tercih edilmektedir
Vorteks karıştırıcı
Biyogüvenlik Kabini
Milli Q Intergral Su Arıtma Sistemi	EMD Kırlangıç	ZRXQ010WW	Herhangi bir sağlayıcıdan Moleküler Biyoloji sınıfı su kullanılabilir
Mikrosantrifüj
merkezkaç
4 °C buzdolabı
BD LSR II	BD Biyolojik Bilimler		Akış sitometresi, kullanılan boyama paneli ile uyumlu lazerler ve filtreler içermelidir.
Deiyonize su
Alüminyum Folyo	VWR BILIMSEL A.Ş.	89068-738
kuvöz			37 °C iç sıcaklığı koruyabilmelidir
FACS Diva yazılımı	BD Biyolojik Bilimler
Flowjo yazılım sürümü 9.6	Akış		FACS Diva yazılımı tarafından oluşturulan FCS dosyalarını analiz etmek için kullanılır
Mikropippette ipuçları

Serisi Serisi Su Serisi