$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Lökositlerin Floresan Etiketlemesi ve Perfüzyonu (İnsan için PMN veya THP-1 ve Murin Akış Tabanlı Test için RAW264.7 veya Birincil Fare Monositleri)
- Floresan etiketleme
- Lökositleri (1 x 106 / mL) hücre bazlı yeşil floresan nükleik asit boyası (1 μM) ile etiketleyin. Hücreleri 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri PBS ile 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile yıkayın ve hücreleri tahlil tamponunda 0.5 x 106 hücre / mL (akış hızına bağlı olarak test koşulu başına 5 mL) konsantrasyona kadar askıya alın.
- Akış odası tahlili hazırlığı
- Bir hücre tek tabakasına lökosit yapışması için, hücre kültürü ortamını çanaktan atın ve akış odasına monte edin. Hortumu şırıngaya bağlayın. İmmobilize trombositler üzerinde lökosit yapışması için mikro slaytı şırıngaya bağlayın. Bir su banyosunu önceden 37 °C'ye ısıtın.
- Bir perfüzyon şırıngası (50 mL) alın, şırıngayı şırınga tutucusuna takın ve pompayı geri çekme moduna getirin. Pompa hacmini 0 mL'ye ayarlayın ve 50 mL şırınga için çapı 26,70 mm'ye ayarlayın.
- Borunun bir ucuna bir dirsek luer konektörü bağlayın. Şırıngaya bir luer kilit kuplörü yerleştirin ve dirsek luer konektörlü boruyu luer kilit kuplörüne bağlayın. Serbest boru ucunu akış odasına bağlayın.
- Lökosit perfüzyonu ve adezyonu
- Bir hücre tek tabakasına lökosit yapışması için, hücre kültürü ortamını çanaktan atın ve akış odasına monte edin. Hortumu şırıngaya bağlayın. İmmobilize trombositler üzerinde lökosit yapışması için mikro slaytı şırıngaya bağlayın.
- Lökosit perfüzyonu ve vasküler veya trombosit tek tabakası üzerine yapışma için, ikinci boruyu tahlil tamponu içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve tüpü 1 mL pipet ile doldurun, ardından boruyu sıkın ve bir akış odasına bağlayın.
- Lökosit perfüzyonundan önce, hücre süspansiyonuna 3 mM CaCl2 ve 2 mM MgCl2 ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Odadan ve borudan olası havayı çıkarmak için hücrelerin perfüzyonundan önce perfüz tahlil tamponu.
- Tüp uçlarını sıkıca sıkarak ve boruyu tahlil tamponundan hücre süspansiyonuna geçirerek kapatın, böylece hava kabarcıklarının sıkışmasını önleyin. İlk hücreler gelene kadar hücreleri uygun akış hızı/kesme gerilimi ile perfüze edin.
- Hücreleri 2 dakika boyunca uygun akış hızı/kesme gerilimi ile perfüze edin ve dijital bir CCD veya CMOS kameraya bağlı 100X büyütme kullanarak ters faz kontrast/floresan mikroskobu (örneğin, EVOS-FL) ile 2-6 dakika arasında yuvarlanan ve yapışık hücrelerin en az 6 resmini çekin.
NOT: Akış hızı/kesme gerilimi, akış odası boyutlarına ve perfüzatın viskozitesine bağlıdır. Burada kullanılan perfüzyon odası için (Malzeme Tablosuna bakınız):
τ=η*97.1*Φ
τ: Kayma gerilimi (1 dyn/cm2)
η: viskozite (0,015 dyn*s/cm2)
Φ: Akış hızı (0.67 mL/dak)
- Lökosit yapışmasının giderilmesi
- Yapışmayı gidermek için, boruyu sıkarak ve hava kabarcıklarının sıkışmasını önleyerek boruyu hücre süspansiyonundan tahlil tamponuna geçirin.
- Hücreleri, uygun bir akış hızı/kesme gerilimi ile tahlil tamponu ile perfüzyon yoluyla ayırın (Bkz. 3.3.7 Not).
- Lökosit göçü
- Lökosit transmigrasyonu için, yeterli miktarda lökosit yapışana kadar (~ 50 hücre / görüş alanı) lökositleri (adım 3) perfüze edin.
- Lökosit süspansiyonunu tahlil tamponu ile değiştirin.
- 37 °C'de 30-60 dakika boyunca her 10-15 saniyede bir geçiş hücrelerini hızlandırılmış olarak kaydedin.