$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Nanoyapı İmalatı
- Nanofabrikasyon için alt tabaka olarak yaklaşık 170 μm (No. 1.5) kalınlığa sahip 25 mm çapında cam lameller seçin.
- Lamelleri en az 6 saat boyunca pirana çözeltisine (3: 1 oranında sülfürik asit ve hidrojen peroksit) daldırın. Piranha ile ıslatılmış lamel bol miktarda ultra saf 18.2 MΩ deiyonize damıtılmış su (DDW) ile yıkayın.
Dikkat: Piranha asidi organik maddelerle şiddetli reaksiyona girer ve çok dikkatli kullanılmalıdır.
- Nanoyapıların modellenmesi ve görüntülenmesi sırasında yük etkilerini önlemek için e-ışın buharlaştırma ile lameller üzerine 10 nm krom ince film bırakın.
- Etil laktat metil metakrilat (MMA_EL6) kopolimerinden oluşan ilk çift katmanlı direnç katmanını 2.000 rpm'de 45 saniye döndürün ve ardından 150 °C'de pişirin. İkinci polimetil metakrilat (950PMMA_A2) katmanını 3.000 rpm'de 45 saniye döndürün, ardından 180 °C'de pişirin.
- 300 μC/cm2'lik bir alan dozu ile 25 kV'da elektron ışını litografisi (EBL) kullanarak iki katmanlı direnci modelleyin. İzopropil alkol (IPA) / metil izobütil keton (MIBK): 2/1 içinde geliştirin ve IPA'da durulayın.
- Bir e-ışınlı evaporatör kullanarak alt tabaka üzerinde Ti (5 nm) / Au (80 nm) film biriktirin.
- Altın birikiminin ardından, alt tabakayı 4 saat aseton içinde bekleterek kopolimer çift katmanlı direnci kaldırın.
- Nanoyapı şeklini ve boyutunu doğrulamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak alt tabakayı inceleyin, kalan kromu RT'de 60 saniye boyunca CR-7 aşındırıcı kullanarak ıslak aşındırma yoluyla alt tabakadan çıkarın ve ardından DDW'de durulayın.
- Diziler arasında hücre görüntülemeye yer bırakmak için 33 μm'lik bir merkezden merkeze dizi aralığı tasarlayın. Nanoyapıları, bir e-ışın yazıcısı kullanarak 300 nm'lik bir aralıkla her dizi için 20 x 20'lik bir desende modelleyin. Her çip, tipik nanoyapı boyutu 80±2,5 nm yükseklik ve 70±2,5 nm çap olan 300 dizi içerir.
- Boyut ve tekdüzeliğin doğrulanması için atomik kuvvet mikroskobunu (AFM) kullanarak dizilerin bir alt kümesini inceleyin.
- UV ile kürlenen bir epoksi kullanarak lamel arkasına tipik olarak silikon olan bir destek halkası takın.
2. Talaş Temizleme ve Kendinden Montajlı Monolayer Uygulaması
- Talaşları temizlemek ve rejenerasyonu için, hazneyi aynı koşullar altında 5 dakika temizledikten sonra 300 mTorr% 5 hidrojen ve% 95 argon karışımında 40 W gücünde plazma külü 45 saniye boyunca plazma külü.
- Çipi, 3: 1 oranında SH-(CH2) 8-EG 3-OH (SPO) ve bir amin veya karboksil fonksiyonel grubuna sahip bir bileşenden oluşan iki bileşenli bir etanolik tiyol çözeltisine daldırarak plazma küllemeden hemen sonra altın nanoyapıları işlevselleştirin, yani, SH- (CH2) 11-EG 3-NH 2 (SPN) veya SH- (CH2) 11-EG 3-COOH (SPC).
- Kendinden montajlı bir tek tabaka (SAM) oluşturmak için çipi tiyol çözeltisi O/N içinde bırakın.
- Çipi etanol ile durulayın ve nitrojen gazı ile kurutun.
- Gerekirse, işlevsel çipi 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- Kullanıma hazır olduğunda, SPN veya SPC bileşenini, tercih edilen liganda bağlı olarak bir kimya kullanarak ligand ile reaksiyona sokun.
not: Çipler onlarca kez yeniden oluşturulabilir ve yeniden işlevlendirilebilir. Belirli bir çip, 6 aydan bir yıla kadar değişen süreler için kullanılabilir. Belirli bir dizide ölçülen spektrumlar, plazma külleme ile tekrarlanan rejenerasyonlardan sonra güvenilir bir şekilde yeniden üretilir ve ardından biyoişlevselleştirme yapılır.
3. Yüzey İşlevselleştirmesi ve Kinetik Karakterizasyonu
Not: Ligand ve analit arasındaki kinetik hız sabitlerini karakterize etmek ve SAM'ın spesifik olmayan bağlanmaya karşı direncini incelemek için ticari SPR cihazındaki işlevselleştirilmiş çipi kullanın. Verimli yüzey işlevselleştirmesine izin veren çok çeşitli akış hızları ve mikroakışkan tasarımlar vardır. Ticari olarak temin edilebilen bir SPR'ye sahip olduğumuzdan, önerilen akış hızlarına göre standartlaştırdık. Bu akış hızlarının tüm SPR cihazları için tipik olduğunu ve bu nedenle kısıtlayıcı olmadığını not ediyoruz. SPR cihazı bir zorunluluk değildir, çünkü tüm işlevselleştirme doğrudan lokalize yüzey plazmon rezonans görüntüleme (LSPR) çipi üzerinde yapılabilir, ancak LSPR mikroakışkan kurulumumuz değilken çoğullanmış bir cihaz olduğu için iş yükümüzü azalttı.
- Bölüm 2'de açıklandığı gibi SAM ile ticari bir çıplak altın çipi işlevsel hale getirin.
- SPC bazlı bir SAM kullanılıyorsa, karboksil grubunu 133 mM 1-etil-3- (3-dimetil aminopropil) karbodiimid (EDC) ve 33 mM N-hidroksisüksinimid (NHS) karışımı ile 10 dakika boyunca DDW'de aktive edin.
- Aktive edilmiş karboksil grubunu, 30 μl/dk'lık bir akış hızı kullanarak 300 saniye boyunca ilgilenilen antikor/ligand ile konjuge edin. Ligandları tipik olarak pH 6 fosfat tamponunda hazırlayın, ancak bu moleküle bağlı olarak değişebilir.
- Ligand konjugasyonundan sonra, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 300 saniye boyunca 30 μl/dk hızında bir deaktivatör adımı olarak 0.1 M etanolamin akışı yapın. Etanolamin, spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmeye yardımcı olur.
- Bir dizi konsantrasyon kullanarak 100 μl/dk'lık bir akış hızında ilgilenilen analiti tanıtın ve kinetik analiz yazılımını kullanarak kinetik hız sabitlerini hesaplayın.
- Spesifik olmayan bağlanma sorunluysa, SPO'nun SPC veya SPN'ye oranını artırın.
4. LSPR Genel Ayarları
- Mikroskop ayarları:
- Koehler'in numuneyi aydınlatması için 100 W Halojen lamba kullanın. Rezonans kaymasına katkıda bulunmayan dalga boylarını ortadan kaldırmak için ışık yolunda uzun geçiren bir filtre (tipik olarak 593 nm kesme) kullanın (Şekil 1).
- LSPRi veri toplama için, 40X yağa daldırma objektifi (1.4 NA) olan ters çevrilmiş bir mikroskop ve termoelektrik olarak soğutulmuş 16 bit CCD kamera kullanın.
- Görüntü ve spektrumları aynı anda elde etmek için mikroskobun çıkış portuna bir ışın ayırıcı yerleştirin.
- Sıcaklık kontrollü mikroskop aşamasını 37 °C'ye ayarlayın ve 4 saat dengeleyin.
- CO2 konsantrasyonunu ve nemini sırasıyla% 5 ve% 95'te düzenlemek için mikroskop üzerine ek bir inkübasyon düzeneği ekleyin.
- Talaş hazırlama ve montaj:
- LSPR çipini, SPR deneylerinden belirlenen optimum iki-8 bileşenli SAM oranlarıyla Bölüm 2'de açıklandığı gibi işlevselleştirin.
- Çipi aşağıdaki gibi özel yapım bir mikroakışkan tutucuya yükleyin. Çipi alüminyum bir alt parçaya yerleştirin. Çipi bu alt parça ile bir silikon conta ve şeffaf plastik bir üst parça arasına sıkıştırın. Düzeneği sıkıştırmak için 4 vida kullanın.
- Tipik bir SPC bazlı tiyol uygulaması için, SPC tiyol bileşeninin karboksil gruplarını aktive etmek için DDW'de 133 mM EDC ve 33 mM NHS'nin 1: 1 karışımını 300 μl damlatın.
- 10 dakika bekleyin ve yüzeyi 10 mM PBS ile manuel olarak durulayın.
- Aktive edilmiş karboksil grubunu, 300 μl ligand çözeltisinin damla kaplaması ile ilgilenilen ligand (tipik olarak bir antikor veya antikor fragmanı) ile konjugasyon yapın.
- 30 dakika bekleyin ve 10 mM PBS ile manuel olarak durulayın.
- Spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için çip üzerindeki PBS'ye 300 μl 0.1 M etanolamin damlatın. 10 dakika bekleyin.
- Etanolamini %0.005 Tween 20 (PBS-T20) içeren PBS ile yıkayın.
- Değişen bir menisküsle ilgili verilerdeki dalgalanmaları azaltmak için çipin üzerine bir kuvars parçası yerleştirin.
- Mikroskoba monte ederken çipi PBS-T20 tamponu ile ıslak tutun.
- LSPR çip düzeneğini ısıtılmış s'ye sıkıca yerleştirin.ample tutucu ve mikroakışkan boruyu takın.
- Mikroakışkan boruyu düzeneğe ve akış tamponuna (veya hücre çalışmaları için serumsuz ortama) sabit bir duruma ulaşılana kadar takın.
- Düzeneğin ve mikroskobun en az 2 saat dengelenmesine izin verin.
- Çipi bir joystick kullanarak hizalayın, böylece merkezi dizi spektroskopi için fiber optik ile hizalanır. Spektroskopik veriler, bir spektrometre ve spektral analiz yazılımı kullanılarak alınır.
- Yazılım otofokusu, Zeiss Definite Focus veya eşdeğer bir otomatik netleme cihazı kullanarak dizileri deney boyunca odakta tutun.
5. 9E10 Hibridoma Hücrelerinden Anti-c-myc Sekresyonlarının LSPR Görüntülemesi
Not: Bu çalışma için kullanılan hibridoma hücre hattı, anti-c-myc antikorunu yapısal olarak eksprese eder ve bu nedenle kimyasal bir tetikleyici gerektirmez
- Nanoyapıları c-myc peptit ile işlevselleştirin. Bu, klon 9E10 hibridoma hücreleri tarafından salgılanan anti-c-myc antikorları için 1.77 nM'lik bir KD değerine sahiptir.
- Hibridoma hücrelerini% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik ile% 5 CO2 altında 37 ° C'de bir T75 şişesinde tam bir büyüme ortamında kültürleyin. 4 ×105 hücre / ml hücre yoğunluğunu koruyun.
- Hücre salgılama çalışmaları için, santrifüjleme yoluyla T75 şişesinden alınan pelet hücreleri, salgılanan antikorları çıkarmak ve hücre yoğunluğunu 4 ×106 hücre / ml'ye ayarlamak için RPMI-1640 serumsuz ortam (SFM) ile iki kez yıkanır.
- Hücreleri hasat edin ve LSPR çiplerine yerleştirmeden önce canlılık açısından test edin.
- 50 μl hücre solüsyonunu bir mikropipet ile LSPR çiplerine manuel olarak verin. Birkaç dakika sonra, LSPR yongalarının yüzeyine 25 ila 50 hücre yapışır.
- Mikroakışkan perfüzyon sistemini kullanarak çözelti içinde kalan hücreleri taze SFM ile yıkayın.
- Görüntüleme için yakın, 10 μm içinde olan ancak hücrelerle örtüşmeyen LSPR dizilerini seçin.
- Sinyalin salgılanan anti-c-myc antikorlarına özgü olduğundan emin olmak için, mevcut antikorlarla ve antikorlarla birlikte, ancak bağlanma bölgeleri çözeltide doymuş bir c-myc peptit konsantrasyonunun varlığı ile bloke edilmiş olarak hücre kültürü ortamını sokun.
- Her çalıştırmanın sonunda sensörleri doyurucu bir anti-c-myc antikor çözeltisi (250 nM) ile kalibre edin. Bu, sensörlerin tepkisini normalleştirmeye ve her çalıştırmanın biyoişlevselleştirme profiline dayalı olarak kesirli doluluğun belirlenmesine yardımcı olur.
- Görüntü hizalama yazılımını kullanarak X ve Y yönündeki kaymayı düzeltin.
