$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Virüs Titrasyonu
>NOT: Virüslerin sayısına ve kopyaların sayısına bağlı olarak, aşağıdaki esnekliklerle bir kuyu plakası kurulabilir: (1) Viral seyreltme, satırlar veya sütunlar boyunca düzenlenebilir (Şekil 1). Her virüs ayrı bir satır/sütun işgal etmelidir. (2) Viral seyreltme artışı esnektir, ancak sol üst köşedeki en yüksek viral konsantrasyonla başlamalıdır. (3) Mükerrer sayısında herhangi bir kısıtlama yoktur.
- Yeterli MDCK hücrelerini veya MDCK-SIAT hücrelerini8 96 oyuklu plakalara (200 μl/oyuk) ayırın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile 2 veya 3 gün boyunca inkübe etmek için inkübe edin. % 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS) ve antibiyotikler (100 U / ml penisilin ve 100 μg / ml streptomisin) ile desteklenmiş DMEM'deki hücreleri çoğaltın. SIAT hücrelerini 37 °C'de %5 CO2 ve 1 mg/ml G418 sülfat ile inkübe edin.
not: Seyreltme faktörü, deneyime ve kullanılan hücre hattına bağlıdır. Virüs aşılaması sırasında hücre tek tabakası birleşik olmalıdır (yani, MDCK hücreleri için hücre duvarı veya görünür bir anahat yoktur ve MDCK-SIAT1 hücreleri için sıkıca paketlenmiş bir düzen). MDCK veya MDCK-SIAT1 hücrelerinin birleşik şişelerinin alt kültürüne dayalı seyreltme örnekleri Tablo 1'de verilmiştir.
- Hücreleri kuyucuk başına 200 μl virüs büyüme ortamı (VGM) ile 3 kez yıkayın. Çok duvarlı plaka yıkayıcıyı 30 dakika boyunca %70 EtOH ile sterilize edin ve ardından yıkamadan önce steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) veya VGM ile durulayın.
- VGM'yi aspire edin ve hemen her oyuğa 50 μl VGM ekleyin.
- 6 steril tüpün her birine 900 μl VGM ekleyin (veya test virüslerinin ve kopyalarının sayısına bağlı olarak daha az). İlk tüpe 100 μl virüs pipetleyin, iyice karıştırın ve her seyreltme arasında uçları değiştirerek seri olarak seyreltin. Titre edilecek her virüs için tekrarlayın.
not: Bu, 10-1 ila 10-6 arasında virüs seyreltmeleri verecektir.
- En yüksek seyreltmeden (Şekil 1'de 1 x 10-5) başlayarak, 96 oyuklu bir plakanın çoğaltılmış kuyucuklarına (Şekil 1'deki Sütun 9 ve 10) başlayarak her virüs seyreltmesinden 50 μl ekleyin.
- Virüsün hücreleri enfekte etmesine izin vermek için plakayı 2-3 saat boyunca 37 ° C'ye yerleştirin.
not: Aşıdaki virüslerin tek tabakaya ulaşmak için yeterli zamana sahip olmasını sağlamak için 2 ila 3 saatlik bir inkübasyon gereklidir.
- Kaplamayı hazırlayın (10 ml / tabak) < br / >
not: Kaplama, 5 ml 2x DMEM, Tripsin (2 μg/ml nihai konsantrasyon), 20 μl 1 mg/ml stok ve 5 ml selüloz pamuk linterinden oluşur (Malzeme Listesine bakınız).
- İnokulumu çıkarın.
- Kaplamayı ekleyin (her oyuğa 200 μl). Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin, BOZULMAMIŞ.
not: Virüs tomurcuklanması yaklaşık 4 saat sonra gerçekleşir, bu nedenle bu süreden sonra plakanın rahatsız edilmemesi önemlidir.
- Kaplamayı kuyulardan aspire edin.
- PBS A'ya (200 μl/kuyu) buz gibi %4 paraformaldehit ekleyin. 4 °C'de 30 dakika veya oda sıcaklığında 20 dakika
NOT: PBS A, 10 g NaCl, 0.25 g KCl, 1.437 g Na2HPO4, 0.25 g KH2PO4 ve 1 L damıtılmış su içeren doğal pH fosfat tamponlu salindir (Malzeme Listesine bakınız).
NOT: Paraformaldehit solunduğunda zararlıdır ve yutulduğunda yanıklara neden olabilir. Ayrıca kanserojen etkiye dair sınırlı kanıt vardır ve cilt temasından sonra hassasiyete neden olabilir.
- Paraformaldehiti aspire edin ve plakaları PBS A (200 μl/kuyu) ile iki kez yıkayın.
- Plakaları ileride kullanmak üzere PBS A'da 4 °C'de saklayın veya aşağıdaki adımlarla devam edin.
- Geçirgenleştirme tamponu (100 μl/kuyu) ekleyin. 30 dakika oda sıcaklığında bırakın.
- Plakayı PBS A (200 μl/kuyucuk) ile iki kez yıkayın.
- Kuyucuk başına 50 μl ilk antikor, influenza tip A'ya karşı fare MAb (ELISA Tamponunda 1: 1.000) ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat (veya gece boyunca 4 °C) çalkalayarak inkübe edin.
- Kuyucuk başına 100 μl yıkama tamponunda (PBS A'da %0,05 Tween 80, v/v) 3 kez yıkayın. Yıkamalar arasında 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Alternatif olarak, kuyucuk başına 300 μl kullanarak inkübasyon olmadan 3 kez yıkayın.
- Kuyucuk başına 50 μl ikinci antikor, keçi anti-fare IgG (H + L) HRP konjugatı (ELISA Tamponunda 1: 1.000) ekleyin. Oda sıcaklığında çalkalayarak 1 saat inkübe edin.
- Adım 1.17'de anlatıldığı gibi 3 kez yıkayın.
- Alt tabakayı ekleyin (50 μl/kuyucuk). Oda sıcaklığında 30 dakika veya mavi bir rengin gelişimi açıkça görülene kadar inkübe edin.
- Reaksiyonu durdurmak için, plakayı kuyucuk başına 200 μl damıtılmış su ile iki kez yıkayın ve yıkamalar arasında 2-3 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Plakayı havayla kurutun ve karanlık bir yerde saklayın (örn. alüminyum folyoya sarın).
2. Virüs Nötralizasyonu
>NOT: Nötralizasyon testi için gereken plaka sayısını hesaplayın. Her plaka bir virüs ve bir dizi antiserum barındırabilir.
>NOT: Antiserum sayısına ve kopya sayısına bağlı olarak, aşağıdaki esnekliklere sahip bir kuyu plakası ayarlanabilir: (1) Serum seyreltmesi bir sıra veya bir sütun boyunca düzenlenebilir (Şekil 2). Her serum ayrı bir satır veya sütun işgal etmelidir. (2) Serum seyreltme artışı esnektir, ancak bir plakanın sol üst köşesindeki en yüksek serum konsantrasyonu ile başlamalıdır. (3) Kopyaların sayısı, antiserumların sayısını dengeler. Daha fazla kopya, deneysel varyasyonları yumuşatmaya yardımcı olabilir. (4) VC sayısı ve hücre kontrol (CC) kopyalarının sayısı esnektir, ancak bunlar aynı zamanda ayrı satırlar veya sütunlar halinde olmalıdır. VC kopyalarının sayısının, antiserumlarınkinden önemli ölçüde daha fazla olması beklenmektedir.
- Hücre tek katmanını, 1.1-1.3 adımlarında olduğu gibi, 2 veya 3 gün önceden hazırlayın.
- Plakanın her bir oyuğuna 50 μl VGM ekleyin.
- VC ve CC için sırasıyla Sütun 11 ve 12'yi kullanın. 1-10.
sütunlarının ilk satırına (A) 1:20 reseptör yok edici enzim (RDE) ile muamele edilen serumun 50 μl alikotunu ekleyin
not: Her virüs ve serum kombinasyonu için, test iki kopya halinde gerçekleştirilir, bu nedenle bir plaka, örneğin, beş antisera karşı test edilmiş bir virüs içerebilir.
- Satır A'dan Satır H'ye (Şekil 2'deki Sütun 1-10) 50 μl aktararak ve Satır H'den 50 μl atarak 2 katlı seri seyreltmeler gerçekleştirin.
- CC kolonunun her bir kuyucuğuna 50 μl seyreltici ekleyin (Şekil 2'deki Sütun 12).
- CC sütunu hariç plakanın her bir oyuğuna 50 μl virüs ekleyin (Sütun 1-11, Şekil 2'deki Satır AH).
- 37 ° C'de 2-3 saat inkübe edin. İnkülumu çıkarın. Her bir oyuğa kaplamayı (200 μl) ekleyin. Gece boyunca 37 °C'de, RAHATSIZ EDİLMEDEN KULUÇKAYA DEĞİŞTİRİN. Plakaları virüs titrasyonunda olduğu gibi sabitleyin ve boyayın (adım 1.11-1.22).
3. Nötralizasyon Ölçümü
- Şekil 2a'da gösterildiği gibi düz yataklı bir tarayıcının tarama alanına bir kuyu plakası yerleştirin. Optimum ve tekrarlanabilir bir görüntüleme konumu sağlamak için L şekli konum sınırını kullanın.
not: Bir taramada iki kuyulu plakayı görüntülemek mümkündür.
- Plakayı tarayın.
- Gerekli viral titreleri hesaplamak için "Wellplate Reader" yazılımını çalıştırın (Şekil 3).
- Bir resim yüklemek için "Resmi yükle" düğmesini tıklayın. Örnekleme eşiğini ayarlamak için kırmızı çubuğu "Genel Eşik" e kaydırın. Efekti incelemek için "Güncelle" düğmesine tıklayın.
- "Nötralizasyon/Titrasyonu Hesapla" kutusunu işaretleyin. ICP'yi ölçmek için "Örnekleme" düğmesine tıklayın. İstendiğinde örnekleme sonuçlarını kaydetmek için "Kaydet" düğmesine tıklayın.
not: Numune alma işleminden sonra, "Nötralizasyon/Titrasyonu Hesapla" kutusu işaretlenirse otomatik olarak "Nötralizasyon ve Titrasyon Hesaplaması" adlı yeni bir pencere açılır.
- Kuyu plakası haritasını yükleyin veya girin. "Nötralizasyon: Enfeksiyon Kesintisi (%)" bölümünde eşiği (örneğin, %50) belirtin.
- Titreleri hesaplamak için "Nötralizasyon İşlemi"ni seçin. Titreleri kontrol edin ve nötralizasyon sonuçlarını kaydetmek için "Kaydet ve Kapat" düğmesine tıklayın.
not: Nötralizasyon, VC'ye karşı önceden tanımlanmış ICP azalması (% 50 veya% 80 gibi) ile serumun en yüksek seyreltilmesinin tersi olarak rapor edilir (Şekil 4'teki Sütun 11'in ortalaması. Temsili Sonuçlarda %50'lik bir ICP azaltımı kullanıldı.
