Memeli Hücrelerinde Toplu Otofajik Sekestrasyon Aktivitesinin Ölçülmesi

Özet

Kaynak: Luhr, M. et al., Laktat Dehidrojenaz Sekestrasyon Testi — Memeli Hücrelerinde Toplu Otofajik Sekestrasyon Aktivitesini Belirlemek İçin Basit ve Güvenilir Bir Yöntem. (2018)

Video, memeli hücrelerinde toplu otofajik sekestrasyon aktivitesini değerlendirmek için bir testi göstermektedir. Laktat dehidrojenaz (LDH) dahil olmak üzere sitozolik proteinleri serbest bırakmak için elektroporasyon kullanır. Sekestre LDH ve toplam hücresel LDH fraksiyonları, LDH sekestrasyonunu değerlendirmek için belirlenir ve genel toplu sekestrasyon aktivitesi hakkında bilgi sağlar.

Protokol

1. Hücre Tohumlama ve Tedavisi

1. 75^cm2 doku kültürü şişelerinde, 37 ° C'de% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde, söz konusu hücre tipi için tercih edilen kültür ortamı kullanılarak kültür yapışma hücreleri. Hücrelerin, birleşikliğe yakın bir hücre katmanına ulaşana kadar büyümesine izin verin.
   not: LNCaP, HEK293, fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler), BJ, MCF-7 ve RPE-1 hücreleri için% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamını kullanın.
   1. Hücreleri 3 mL 37 °C fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 ile yıkayın. PBS'yi 3 mL% 0.25 (a / h) Tripsin-etilendiamintetraasetat (EDTA) ile değiştirin ve şişeyi, hücreler ayrılana kadar (2-5 dakika) 37 ° C'de% 5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
   2. Ayrılan hücreleri% 10 FBS içeren 7 mL'lik bir kültür ortamı ile yeniden süspanse edin. 0,5-20 μL'lik bir pipet ucu kullanarak bir mikrosantrifüj tüpünde 10 μL'lik bir hücre süspansiyonu alikotunu 10 μL% 0.4 Tripan Blue ile karıştırın. Bir sayma odası slaytını hemen doldurmak için aynı pipet ucunu kullanın ve hücreleri otomatik bir hücre sayacında sayın.
2. % 10 FBS içeren bir kültür ortamı kullanarak adım 1.1.2'den hücre süspansiyonunun uygun bir seyreltmesini (aşağıdaki nota bakın) hazırlayın ve aseptik teknik kullanarak 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının (yüzey alanı ~ 3.8 cm²) her bir oyuğuna 1 mL seyreltilmiş hücre süspansiyonu tohumlayın. İstenen hücre yoğunluğuna ulaşılana kadar, örneğin hasatta% 60-90 birleşme olana, 37 ° C'de% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde büyümeye izin verin.
   not: Hasatta istenen hücre birleşmesini sağlayacak hücre süspansiyonunun uygun seyreltilmesi, hücre tipinden hücre tipine değişeceği gibi, deneysel tedavilerin süresine ve türüne göre de değişecektir. Bu nedenle, bu her durumda ampirik olarak değerlendirilmelidir.
   1. Tohumlamadan 2 gün sonra hem işlenecek hem de hasat edilecek deneyler için, 2.5 x 10⁵ LNCaP, HEK293 veya MCF-7 hücreleri, 5 x 10⁴ MEF, 4 x 10⁵ BJ veya 1.5 x 10⁵ RPE-1 hücreleri 12 oyuklu plakanın her bir oyuğunda.
   2. Gevşek bir şekilde yapışan hücreler için, plakaları söz konusu hücre tipi için önerilen kaplama türü ile kaplayın. LNCaP (ve HEK293) hücreleri için poli-D-lizin (PDL) ile kaplanmış plakalar kullanın.
   3. Bu amaçla, her bir oyuğa steril H₂O içinde 2,5 μg / mL'de 500 μL PDL ekleyin ve plakaları steril bir ortamda oda sıcaklığında (20-25 ° C) 30 dakika inkübe edin. PDL'yi emme ile çıkarın ve her bir kuyuyu 1 mL steril H₂O ile kısa bir süre yıkayın.
      not: Genel olarak, adım 1.2.1 herhangi bir deneysel tedavi olmadan yapılır. Bununla birlikte, RNAi gerçekleştiriliyorsa, tohumlama ile ters bir transfeksiyon başlatmak uygun olabilir.
3. Koşul başına iki veya üç katlı kuyucuklarda deneysel tedaviler gerçekleştirin.
   1. Örneğin, hücreleri genellikle otofajik sekestrasyonun etkili bir indükleyicisi olan 50 nM mTOR inhibitörü Torin1 ile tedavi edin veya hücreleri 1 mL amino asit içermeyen Earle'nin Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) ortamı ile yıkayarak hücreleri akut serum ve amino asit açlığına maruz bırakın ve ardından hücreleri 37 ° C'de% 5 karbondioksit (CO₂) içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 1 mL EBSS içinde inkübe edin.
   2. Sedimantabl laktat dehidrojenazın (LDH) arka plan seviyelerini tanımlamak için bir dizi kuyuyu tedavi edilmeden bırakın.
   3. Hücre hasadından 3-4 saat önce, deneysel tedavilerin yokluğunda veya varlığında, sekestrasyon sonrası inhibitör bafilomisin A1'in (Baf) doyurucu bir miktarını ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
      1. LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 ve RPE-1 hücreleri için 100 nM Baf ve MEF'ler için 10 nM Baf kullanın.
      2. Sadece 3-4 saatlik bir süreye sahip deneysel tedaviler için (tipik olarak adım 1.3.1'de örneklenenler gibi), tedavilerle aynı anda Baf ekleyin. Daha uzun deneysel tedaviler için, hasattan 3-4 saat öncesine kadar bekleyin ve 2 μL 500x konsantre Baf stoğunu doğrudan ortama ekleyin.
      3. Baf ilavesinden hemen sonra plakayı çalkalayarak karıştırın. Bu noktada, kontrol olarak makrootofajik sekestrasyon inhibitörlerinin eklenmesi de tavsiye edilir, ör., pan-fosfoinositid 3-kinaz (PI3K) inhibitörü 3-metil adenin (3MA) 10 mM veya seçici PI3K sınıf III inhibitörü SAR-405'in 10 μM'si.

2. Hücre Hasadı ve Elektro-Bozulma için Hazırlık

1. Tedavi süresinin sonunda, ortamı emme ile aspire edin ve her bir oyuğa 200 μL hücre ayırma çözeltisi (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış) ekleyin. Hücreler ayrılana kadar (tipik olarak yaklaşık 5 dakika) 37 ° C'de inkübe edin.
   not: Hücre ayırma çözeltisi yerine %0.25 (a/h) Tripsin-EDTA kullanılabilirken, ikincisi, ayrılan hücrelerin viskozitesini azaltmaya yardımcı olan DNaz içerir. Ortam iyice aspire edildiği sürece, Tripsin-EDTA veya hücre ayırma çözeltisi eklenmeden önce hücrelerin yıkanması gerekli değildir.
2. Her oyuğa %2 (a/h) sığır serum albümini (BSA) içeren 500 μL oda sıcaklığında (20-25 °C) PBS, pH 7.4 ekleyin ve hiçbir hücre kümesi görünmeyene kadar pipetle yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu hemen buz üzerindeki 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
   not: Aksi belirtilmedikçe, sonraki tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
3. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleme ile çökeltin.
4. Hücre peletlerini mümkün olduğunca kuru bırakmak için süpernatanı (emme ile) iyice aspire edin.
5. Her tüpe 400 μL% 10 (a / h) sükroz (ultra saf H₂O cinsinden) ekleyin.

3. Plazma Membran Elektrobozulması ve Sedimantabl ve Toplam Hücre Fraksiyonlarının Ayrılması

1. Neredeyse tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre peletini bir pipetle yeniden süspanse edin ve 4 mm'lik bir elektroporasyon küvetine aktarın.
   not: 100–1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak ~10–15 kez yukarı ve aşağı pipetleme yapmak genellikle yeterlidir.
2. Küveti üstel bozunma dalgası elektroporatörüne yerleştirin ve 800 V, 25 μF ve 400 Ω'de tek bir elektrik darbesini boşaltın; bu ayarlar ~8 ms süreli bir darbe üretir.
3. Hücre bozulmasını 400 μL buz gibi soğuk fosfat tamponlu sükroz çözeltisi (100 mM sodyum monofosfat, 2 mM ditiotreitol (DTT), 2 mM EDTA ve %1,75 sükroz, pH 7,5) içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için yeni bir pipet ucu kullanın ve pipetleme ile kısa bir süre karıştırın.
   1. İsteğe bağlı: Verimli plazma membranı elektro-bozulmasını doğrulamak için, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1.3. adımdan 10 μL seyreltilmiş hücre bozucusunu 10 μL% 0.4 Tripan Mavisi ile karıştırın. Bir sayım odasına aktarın ve Tripan Mavisi pozitif hücrelerin yüzdesinin %>99) olduğunu doğrulayın.
      1. Numuneyi oda sıcaklığında (20–25 °C) 30 dakika boyunca sayım odasında bırakın ve Tripan Mavisi pozitif hücrelerin yüzdesinin %>99) kaldığını doğrulayın.
   2. İsteğe bağlı: Elektro-bozulmanın çok sert olmadığını, yani hücre içi organelleri bozmadığını doğrulamak için, yukarıda açıklandığı gibi 1.1-3.3 adımlarını gerçekleştirin, ancak daha büyük bir başlangıç materyali kullanın (~%80 birleşik hücre katmanına sahip 6 oyuklu bir plakadan bir kuyu) ve adım 2.5'te 150 μL %10 sükroz ve adım 3.3'te DTT'siz 150 μL fosfat tamponlu sükroz çözeltisi kullanın.
      1. 200 μL seyreltilmiş hücre bozma çözeltisini, fosfat tamponlu %8 (a/h) yoğunluklu gradyan ortamının 1.2 mL yoğunluk yastığının üzerine dikkatlice katmanlamak için bir pipet kullanın (örn.% 8 Nycodenz, 50 mM sodyum fosfat,% 2.2 sükroz, 1 mM EDTA) 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde. Yumuşak mod fonksiyonlu bir mikrosantrifüjde (hafif hızlanma ve yavaşlama için) 4 ° C'de 45 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin ve tüpleri dikkatlice buzun üzerine koyun.
      2. ~200 μL'lik üst fraksiyonun 60 μL'sini dikkatlice çıkarın, herhangi bir yoğunluk gradyanlı orta çözeltisi almadığınızdan emin olun ve yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
         not: Bu, "hücre özü" olarak adlandırılan olağanüstü saflıkta sitozol içermelidir.
      3. Yukarıdaki adımda elde edilen fraksiyonun saflığını, standart teknikler ve %4-20 gradyan jeller kullanarak organel içeren proteinlerin western blot analizlerini gerçekleştirerek test edin.
      4. Örneğin, adım 3.2'deki elektrik şokunun sırasıyla lizozomları, mitokondriyi veya endoplazmik retikulumu bozmadığını doğrulamak için katepsin B, sitokrom c ve protein disülfid izomerazı için immünoblotlama yapın ve LDH için hücre özsuyunda sitozolik bir proteinin varlığını doğrulamak için immünoblot yapın.
      5. Paralel olarak, kullanılan antikorların değerlendirilmekte olan organel içeren proteinleri tespit edebildiğini doğrulamak için toplam hücre bozucu çözeltiden yapılan protein ekstraktları üzerinde immünoblotlama yapın.
4. Her örnek için 3.1–3.3 adımlarını tekrarlayın.
5. Her seyreltilmiş hücre bozma çözeltisinden (adım 3.3'te elde edilir) 550 μL'yi, 900 μL buz gibi soğuk resüspansiyon tamponu (50 mM sodyum monofosfat, 1 mM DTT, 1 mM EDTA ve %5.9 sakaroz, pH 7.5) içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerine çıkarın ve %0.5 BSA ve %0.01 Tween-20 ile desteklenmiş ve pipetleme ile kısaca karıştırın.
6. "Çökeltilmiş LDH" içeren peletler üretmek için 4 °C'de 45 dakika boyunca 18.000 x g'da santrifüjleyin. Peletleri mümkün olduğunca kuru bırakmak için süpernatanı (emme ile) iyice aspire edin. Numuneleri -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
7. Her seyreltilmiş hücre bozucu çözeltisinden (adım 3.3'te elde edilir) 150 μL'yi yeni tüplere aktarın ve numuneleri -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin. Hücrelerdeki "toplam LDH" seviyelerini belirlemek için bu örnekleri kullanın.
   not: Bu noktada, deney istenildiği kadar duraklatılabilir.

4. LDH Ekstraksiyonu ve LDH Enzimatik Aktivitesinin Ölçülmesi

1. "Çökelmiş LDH" (adım 3.6'dan itibaren) ve "toplam LDH" örneklerini (adım 3.7'den itibaren) buz üzerinde çözün.
2. "Toplam LDH" numunelerine %1,5 Triton X-405 içeren 300 μL buz gibi soğuk yeniden süspansiyon tamponu ekleyin (%1'lik bir nihai Triton X-405 konsantrasyonu verir). Numuneleri soğuk bir odada (4–8 °C) bir rulo üzerinde 30 dakika döndürün.
3. "Sedimente LDH" numunelerine %1 Triton X-405 içeren 750 μL buz gibi soğuk yeniden süspansiyon tamponu ekleyin ve homojen bir çözeltiye ulaşılana kadar peletleri bir pipet ile yeniden süspanse edin.
4. Çözünmemiş hücresel kalıntıları çökeltmek için 4.2 ve 4.3 adımlarındaki numuneleri 18.000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
5. 4 ° C'de en az üç hafta stabil çalışan bir çalışma çözeltisi elde etmek için 4 kısım soğuk 65 mM imidazol (pH 7.5) / 0.75 mM piruvat ile bir kısım soğuk 65 mM imidazol (pH 7.5) / 1.8 mM NADH karıştırın.
6. Adım 4.4'teki süpernatanların 3-30 μL'sini 200 μL adım 4.5 çalışma çözeltisi ile karıştırın.
7. Bilinen bir LDH konsantrasyonuna sahip bir standarda kıyasla 37 ° C'de 340 nm'de nikotinamid adenin dinükleotid (indirgenmiş form) (NADH) absorbansındaki düşüş olarak LDH enzimatik aktivitesini ölçerek LDH miktarını belirleyin. Reaksiyon tamamlanmaya yaklaşana kadar, yani 340 nm'deki absorbans zamanla artık değişmeyene kadar absorbans ölçümleri yapın.
   not: Bu, LDH aktivitesini ölçmek için klasik biyokimyasal yöntemdir. Mevcut protokol reaksiyonu 37 °C'de gerçekleştirse de, oda sıcaklığında (20-25 °C) da gerçekleştirilebilir, bu da manuel spektrofotometri yapılıyorsa tavsiye edilir. Mevcut protokol, numuneleri otomatik bir şekilde 96 oyuklu bir plakada çalışma solüsyonu ile karıştıran ve 3 dakika boyunca her 20 saniyede bir 37 °C'de 340 nm'de absorbansı ölçen robotik bir çoklu analizör cihazı kullanır. Daha sonra, cihaz yazılımı, bilinen bir LDH konsantrasyonu standardı ile kalibrasyon yoluyla elde edilen standart bir eğri ile karşılaştırıldığında, absorbans ölçümlerinin zaman içindeki eğimini karşılaştırarak, Birimler (U)/L olarak ifade edilen LDH konsantrasyonunu hesaplar. Bu yaklaşımla doğrusal algılama aralığı 30–1.500 U/L'dir. Alternatif olarak, LDH'yi ölçmek için ticari olarak temin edilebilen çok çeşitli kitler mevcuttur. Bazıları, enzimatik reaksiyonun kolorimetrik veya floresan ürünlerin üretilmesine bağlanmasına dayanır, bu da UV spektrofotometrisi dışındaki yollarla ve diğer doğrusal algılama aralıklarıyla algılamayı mümkün kılar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 ml ve 2 ml mikrosantrifüj tüpleri	Eppendorf Belediyesi	211-2130 ve 211-2120
12 oyuklu plakalar	doğan	353043
Accumax hücre ayırma çözümü	Yenilikçi Hücre Teknolojileri	A7089	Alikotları yıllarca -20 °C'de ve buzdolabında birkaç ay saklayın
Bafilomisin A1	Arjantin	BML-CM110-0100	DMSO'da çözün
BJ hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-2522	Geçişte kullanım <30
Sığır serum albümini (BSA)	VWR (VWR)	422361V
Burker sayma odası	Balıkçı Bilimsel	139-658585
Kontes Hücre Sayma Odası Slaytları	ThermoFisher Bilimsel	C10228
Kontes II Otomatik Hücre Sayacı	ThermoFisher Bilimsel	AMQAX1000
Burker sayma haznesi için kapak camı	Balıkçı Bilimsel	139-658586
Criterion Tris-HCl Jel, %4–20, 26 kuyucuklu, 15 μl, 13,3 x 8,7 cm (G x U)	Biyo-Rad	3450034
DTT (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632
Earle'ün dengeli tuz çözeltisi (EBSS)	Gibco (Gibco)	24010-043	Conatainler% 0.1 glikoz
Edta	Sigma-Aldrich	E7889
Elektroporasyon küveti (4 mm)	Biyo-Rad	1652088
Üstel bozunma dalgası elektroporatörü	BTX Harvard Aygıtı	EMC 630
Fetal sığır serumu (FBS)	Sigma	F7524	RPMI 1640 ortamında %10 nihai konsantrasyon
HEK293 hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-1573
İmidazol	Sigma-Aldrich	56750	65 mM'lik bir çözeltiyi otoklavlayın ve aylarca buzdolabında saklayın
kuvöz; Autoflow IR Doğrudan Isı CO2 inkübatörü	NuAire	NU-5510E
Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon Reaktifi	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	13778150
LNCaP hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-1740	Geçişte kullanım <30
3-Metil Adenin (3MA)	Sigma-Aldrich	M9281	-20 °C'de RPM'de 100 mM stoklayın. Stoku 10 dakika boyunca 65 °C'ye ısıtın ve 10 mM nihai konsantrasyonda kullanın
Buzdolabına Dayanıklı Mikrosantrifüj	Beckman Coulter Yaşam Bilimleri	368831
Yumuşak mod fonksiyonlu buzdolabına dayanıklı Mikrosantrifüj	Eppendorf Belediyesi	Eppendorf 5417R
MRT67307 hidroklorür (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	ULK kinaz aktivitesini inhibe eder. DMSO'da çözün.
MaxMat Multianalizör cihazı	Erba Diagnostik	PL-II
MCF7 hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	HTB-22
NADH (Kuzey Amerika Demokratik Güç	Merck-Kırlangıç	1.24644.001
Nycodenz Belediyesi	Eksen Kalkanı	1002424
Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	31985062
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Gibco (Gibco)	20012-019
Pipet uçları 3 (0,5-20 μl)	VWR (VWR)	732-2223	Thermo Fischer ART Bariyer ipuçları
Pipet uçları (1-200 μl)	VWR (VWR)	732-2207	Thermo Fischer ART Bariyer ipuçları
Pipet uçları (100-1000μl)	VWR (VWR)	732-2355	Thermo Fischer ART Bariyer ipuçları
Pipetler	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	4701070	Finnpipette F2 GLP Kiti
Poli-D-lizin	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	Steril H2O'da 1 mg / ml stok çözeltisi yapın. Bu çözelti -20 °C'de en az 1 yıl stabildir.
Piruvat	Merck-Kırlangıç	1066190050
RPE-1 hücreleri (hTERT RPE-1)	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-4000
dev/dak 1640	Gibco (Gibco)	21875-037
SAR-405 Zırhlı Uçak	ApexBio (İngilizce	A8883	Fosfoinositid 3-kinaz sınıf III'ü (PIK3C3) inhibe eder. DMSO'da çözün.
Susturucu Seçimi Negatif Kontrol #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
Susturucu Seçimi ATG9 hedefleme siRNA (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	S35504
Susturucu Seçimi FIP200 hedefleme siRNA (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	S18995
Susturucu Seçimi ULK1 hedefleme siRNA (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	S15964
Susturucu Seçimi ULK2 hedefleme siRNA (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	S18705
Susturucu Seçimi GABARAP hedeflemeli siRNA (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	S22362
Susturucu Seçimi GABARAPL1 hedeflemeli siRNA (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	S24333
Susturucu Seçimi GABARAPL2 hedeflemeli siRNA (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	S22387
Sodyum fosfat monobazik dihidrat (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Kırlangıç	1.06580.1000
Sodyum fosfat dibazik dihidrat (Na2HPO4 • 2H2O)	Prolabo (Prolabo Balığı)	28014.291
Sakaroz	VWR (VWR)	443816T	Suda% 10 nihai konsantrasyon; 0.45 μm filtreden süzün ve aylarca buzdolabında saklayın
Thapsigargin Mantarı	Sigma-Aldrich	T9033	SERCA ER Ca2+ pompasını engeller. DMSO'da çözün.
Triton X-405	Sigma-Aldrich	X405	%1 final
Tripan Mavi leke %0,4	Moleküler Problar	T10282
Tripsin-EDTA (% 0.25 w / v Tripsin)	Gibco (Gibco)	25200-056
Ara-20	Sigma-Aldrich	P2287 Serisi	0.01% final