1. M. tuberculosis mc26206 (Mtb-GFP) İfade Eden Yeşil Floresan Protein için Kültür Koşulları
NOT: Plazmid pMN437'yi eksprese eden gfp (yeşil floresan proteini) ile dönüştürülen M. tuberculosis H37Rv'den türetilmiş oksotrof suşu mc26206 (ΔpanCD, ΔleuCD) bu protokol boyunca kullanılır. Araştırmacılar için suşun daha kolay erişilebilirliğini sağlamak için Mtb-GFP suşunu, gfp eksprese eden vahşi tip suş ile değiştirmek mümkündür. Bununla birlikte, fagositozun görsel olarak doğrulanmasını ve Mtb / makrofaj agregatlarının oluşumunu sağlamak için gfp ekspresyonu arzu edilir. Uzun süreli depolama için Mtb-GFP, %20 gliserol ile desteklenmiş tam 7H9 ortamında (adım 1.1'de açıklanmıştır) -80 °C'de donduruldu.
- 7H9 ortamını %10 Middlebrook OADC (Oleik Albümin Dekstroz Katalaz),% 0.02 tyloxapol, 24 μg / mL D-pantotenik asit, 50 μg / mL L-lösin ve 50 μg / mL Higromisin B ile takviye ederek tam Mtb-GFP ortamını (7H9-C) hazırlayın.
- Bir şişe Mtb-GFP'yi çözün ve 30 mL kare tabanlı bir PETG şişesine 10 mL 7H9-C ekleyin.
- Döner bir çalkalayıcı (50 rpm) üzerinde 37 °C'de inkübe edin. OD600 1.0'a ulaşana kadar (yaklaşık 5-8 gün) birkaç günde bir optik yoğunluk ölçümleri (OD600) yapın.
- Bir OD600'ü 0.2-1.0 arasında tutmak için gerektiği gibi seyreltin ve geçiş kültürü
.
- Enfeksiyon için, logaritmik büyüme fazı içinde yerleşik bir Mtb-GFP kültürü kullanın (0.6-1'in OD600'ü). Topaklanmış kültürleri önlemek için, Mtb kültür şişesini haftada bir veya iki kez bir su banyosunda (130 W; 3 x 5 s darbe) sonikleştirin.
2. THP-1 Hücreleri için Kültür Koşulları
- RPMI 1640 ortamını %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin ve 10 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit) ile takviye ederek tam THP-1 hücre ortamını (RPMI-C) hazırlayın.
- Hücreleri bir T-75 şişesinde 37 ° C'de% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin.
- Her gün bir hemositometre veya akış sitometrisi kullanarak hücreleri sayın ve THP-1 hücrelerini mL başına 0.1 ila 0.6 milyon arasında bir yoğunlukta tutun.
3. Mtb/Makrofaj Agrega Yapıları Oluşturmak için Enfeksiyon Protokolü
- THP-1 hücre hazırlığı (96 oyuklu plaka başına)
- 7 x 106 THP-1 hücresini 250 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. 7 mL RPMI-C'de yeniden süspansiyon edin.
- Mtb-GFP hazırlığı
- OD600 1.0 = 3 x 108 bakteri / mL dönüşümü kullanarak sallanan kovalı bir santrifüjde 5 dakika boyunca 3.200 x g'de 2.8 x 108 Mtb-GFP'yi santrifüjleyin.
- RPMI-C ile bir kez yıkayın ve adım 3.2.1'deki gibi santrifüjleyin.
- 7 mL RPMI-C'de tekrar süspansiyon ve 10 saniye boyunca girdap.
- Enfeksiyon
NOT: Şablon için Şekil 1'e bakın.
- Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için bir su kenarı için A ve H sıralarına ve sütun 1 ve 12'ye 200 μL steril su ekleyerek 96 oyuklu bir plaka hazırlayın.
- Arka plan kontrolü (Boş) için sütun 2'ye (B2 ila G2) 200 μL RPMI-C ekleyin.
- Enfekte etmek için, THP-1 hücre süspansiyonuna (adım 3.2) Mtb-GFP süspansiyonu (adım 3.1) ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Son THP-1 hücre yoğunluğu mL başına 5 x 105'tir ve karşılık gelen enfeksiyon çokluğu 40'tır.
- THP-1/Mtb-GFP süspansiyonunu 25 mL'lik bir rezervuara dökün.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak kalan tüm 96 kuyucuğa (B3 ila G11) 200 μL THP-1/Mtb-GFP süspansiyonu ekleyin.
not: Birden fazla 96 oyuklu plaka ile çalışıyorsanız, her bir oyuğa eşit bir karışım eklendiğinden emin olmak için rezervuarda kalan THP-1/Mtb süspansiyonunu düzenli olarak yeniden askıya alın.
- 37 ° C'de% 5 CO2 ile 7-10 gün inkübe edin.
- Her bir oyuğun üstünden 100 μL kullanılmış ortamı yavaşça çıkararak ve çok kanallı bir pipet kullanarak 100 μL önceden ısıtılmış RPMI-C'yi nazikçe ekleyerek ortamı 2 günde bir değiştirin. Kuyuları yeniden askıya almayın ve kuyuların dibindeki Mtb/makrofaj agregatlarını bozmayın.
- Mtb / makrofaj agregatlarının boyutuna dikkat ederek kuyuları her gün floresan mikroskobu (4-10X objektif) ile görsel olarak inceleyin. 7-10. güne kadar, Mtb/makrofaj agregatları, ilaç etkinliği testine devam etmek için yeterince büyük olmalıdır (referans için Şekil 2'ye bakınız) (Bölüm 4).
- İstenirse, Mtb/makrofaj agrega oluşumunu belgelemek için parlak alan ve GFP filtre setleri ile donatılmış otomatik bir hücre görüntüleme sistemi kullanarak 96 kuyunun görüntülerini yakalayın.
not: Kullanıcıların otomatik bir görüntüleme sistemine erişimi yoksa, GFP ve parlak alan özelliklerine sahip herhangi bir uygun mikroskop kullanılarak temsili kuyuların görüntüleri alınabilir.
4. Mtb / Makrofaj Agregatlarından Türetilen Mtb'ye Karşı İlaç Etkinliğini Değerlendirmek İçin Büyüme İnhibisyonu Testi
- İlaç hazırlama (iki ilaç için üçlü koşullar)
NOT: Şablon için Şekil 1A'ya bakın.
- Ayrı bir 96 oyuklu plakada, B2'den G10'a kadar 125 μL 7H9-C ortamı ekleyin.
- Adım 4.2.4'teki seyreltmeyi hesaba katmak için 1 mL 7H9-C'de istenen en yüksek nihai konsantrasyonun iki katında iki ilaç hazırlayın.
- Üçlü tedaviler için sırasıyla B11-C11-D11 ve E11-F11-G11 kuyularına her ilacın 250 μL'sini ekleyin.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, 125 μL'yi B11-G11'den B10-G10'a hareket ettirerek test ilaçlarını iki kat seri olarak seyreltin. Her adımda 5 kez pipetleyerek karıştırın.
- Plaka boyunca 125 μL'yi sütundan sütuna (sağdan sola) hareket ettirmeye devam edin ve 4. sütundan sonra durun.
- Sütun 4'ü karıştırdıktan sonra, 125 μL'yi bir atık kabına atın. Sütun 2 ve 3, arka plan (Boş) ve pozitif büyüme kontrolleri olarak kullanıma izin verecek herhangi bir ilaç içermemelidir.
not: Alternatif olarak, ilaç kitaplıklarını test etmek için Şekil 1B'deki şablonu izleyin. Her 96 oyuklu plaka, tek bir konsantrasyonda 58 ilacı barındırabilir. Bu ilaç plakasını, adım 4.2.4'te yarıya indirileceği için istenen nihai konsantrasyonun iki katı kullanarak hazırlayın.
- İlaç tedavisi:
- Mtb ile enfekte olmuş makrofajları (Mtb / makrofaj agregatları) içeren 96 oyuklu plakayı alın.
- İlgili tüm kuyucukları (B2 ila G11) çok kanallı bir pipetle dikkatlice boşaltın. Bunu iki adımlı bir şekilde gerçekleştirin: önce plakayı eğmeden 150 μL'yi çıkarın ve ardından plakayı eğerek ve pipet ucunu kuyunun alt kenarına sokarak kalan ortamı (~50 μL) çıkarın. Mtb/makrofaj agregaları kuyu dibine yapışık olduğu için herhangi bir materyal kaybı yaşanmamalıdır.
- Mtb / makrofaj agregalarını içeren plakanın tüm ilgili kuyucuklarına (B2 ila G11) yavaşça 100 μL 7H9-C ortamı ekleyin.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, ilaç içeren 96 oyuklu plakadan (adım 4.1) 100 μL'yi enfeksiyon plakasının karşılık gelen oyuklarına aktarın.
- Kapalı bir torbaya koyun ve 37 °C'de 3 gün inkübe edin.
5. Resazurin Mikrotitre Testi Kullanılarak İlaç Etkinliğinin Ölçülmesi
- H2O'da 0.8 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda resazurin stokçözeltisini hazırlayın. Sterilizasyon için 0.22 μm gözenek boyutu poliviniliden florür (PVDF) membranından süzün.
- Resazorin stok çözeltisi, H2O ve Tween-80'i (H2O içinde% 20 çözelti) 2: 1: 1 oranında karıştırarak resazurin çalışma çözeltisini hazırlayın. Nihai konsantrasyonlar 0.4 mg / mL resazurin ve% 5 Tween-80'dir.
- Bir plaka okuyucu kullanarak, 37 °C'de 24 saat boyunca her 30 dakikada bir 530 nm uyarılmada floresan ve 590 nm emisyon okumak için bir program ayarlayın. Plaka okuyucuyu 37 °C'ye önceden ısıtın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak ilaçla tedavi edilen plakanın (adım 4.11) ilgili tüm kuyucuklarına (B2 ila G11) 20 μL resazurin çalışma solüsyonu ekleyin.
- Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve adım 5.3.
'da ayarlanan programı başlatın
not: Yüksek hacimli tahlil plakalarının işlenmesini kolaylaştırmak için, tahlili 37 °C'lik bir inkübatörde geliştirmek ve her 24 saatte bir tek floresan okumaları yapmak yeterlidir. Bu, kinetik ve inkübasyon özelliklerine sahip bir plaka okuyucuya erişimi olmayan kullanıcılar için de geçerlidir.
