Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Gün 1
>NOT: Aşağıda açıklanan tüm adımları, bir BSL-2 laboratuvarında doku kültürü için kullanılan steril laminer akışlı biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
- Serum örneklerini oda sıcaklığında çözdürün ve her serum örneğinin 100 μL'sini steril bir tüpe aktarın. Bir su banyosunda veya sıcaklığı ayarlanabilir bir termomikserde 56 ° C'de 30 dakika boyunca ısıtın. Soğuk RPMI-10 (% 10 fetal sığır serumu ile RPMI) kullanarak serum örneğinin 1: 1 ila 1: 1.000 arasında değişen 10 kat seri seyreltmelerini yapın.
- 10 μL seri olarak seyreltilmiş serum örneğini steril 96 oyuklu bir V-alt plakanın her bir oyuğuna aktarın. Sadece RVP'li ve serum numunesi olmayan RPMI-10 ve sadece RVP'ler olmadan ve serum numunesi olmayan RPMI-10 olmak üzere iki set kontrol kuyusu ekleyin. Her serum örneğini ve RPMI-10 kontrollerini üç kopya halinde ayarlayın.
- Dang humması-1, 2, 3 ve 4 RVP'leri -80 °C dondurucudan çıkarın ve 37 °C su banyosunda çözdürün. Çözülmüş RVP'leri hemen buza aktarın. Her serum numunesi için yaklaşık 170 μL RVP elde edin (her serum seyreltmesi için 10 μL RVP x 3 kuyucuk (1: 1, 1: 10, 1: 100, 1: 1.000) ve sadece RVP kontrol kuyucuklu RPMI-10'un her biri için 10 μL RVP x 3 kuyucuk
).
- Serum örneğini içeren 96 oyuklu V-alt plakanın her bir oyuğuna ve RVP'li (serumsuz) kontrol kuyucuklu RPMI-10'a 10 μL RVP pipetleyin. RVP'leri yalnızca RPMI-10 (serum örneği ve RVP yok) kuyucuklarına eklemeyin. 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Her bir soğuk RPMI-10'a RVP'ler yerine 10 μL soğuk RPMI-10 ekleyin (serum örneği yok ve RVP yok) kontrol kuyucukları.
- 96 oyuklu V-alt plakayı bir inkübatöre aktarın ve plakayı %5 CO2 varlığında 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. 96 oyuklu V tabanlı plaka inkübe edilirken, biyogüvenlik kabininin yüzeyini %70 etanol ile temizleyin ve UV ışığını 15 dakika boyunca çalıştırın.
- İnkübatörden tamamen birleşik bir T75 K562 hücre şişesini çıkarın, steril 5 mL'lik bir pipet kullanarak hücreleri iyice karıştırın ve 5 mL hücreleri steril 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
not: K562 hücreleri RPMI-10'da tutulur ve 1 x 106 / mL'de alt kültürlenir.
- Steril 15 mL konik tüpten 10 μL hücre çıkararak hücre sayısını sayın ve 10 μL tripan mavisi ile karıştırın. 15 mL konik tüpteki toplam hücre sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
- 15 mL'lik konik hücreleri ~ 1.200 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı boşaltın ve hücreleri 80.000 hücre / 30 μL ortam (2.66 x 106 hücre / mL) konsantrasyonunda ılık RPMI-10'da yeniden süspanse edin.
- 96 oyuklu V-alt plakasını inkübatörden çıkarın (adım 1.6), 96 oyuklu V-alt plakanın her bir oyuğuna 30 μL K562 hücresi aktarın ve 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. 96 oyuklu V-alt plakayı bir inkübatöre aktarın ve plakayı% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- 1 saat inkübe ettikten sonra, 96 oyuklu V-alt plakayı inkübatörden çıkarın ve 5 dakika boyunca ~ 1.200 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, plakayı baş aşağı çevirerek% 10 ağartıcı içeren bir kaba çevirerek ortamı kuyulardan boşaltın.
- Hücreleri 125 μL ılık RPMI-10'da yeniden süspanse ederek her bir oyuğu yıkayın, bir pipetle iyice karıştırın ve plakayı ~ 1.200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Plakayı baş aşağı çevirerek ortamı %10 çamaşır suyu içeren bir kaba boşaltın. Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
- Yıkadıktan sonra, her bir oyuğa 100 μL ılık RPMI-10 ekleyin, pipetle yukarı ve aşağı karıştırın ve plakayı% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
2. Gün 3
- 100 μL hücre ve ortam/kuyu içeren 96 oyuklu V-alt plakayı inkübatörden çıkarın ve bir biyogüvenlik kabinine taşıyın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir oyuğun içeriğini karıştırın ve hücreleri ve ortamı 96 oyuklu U-tabanlı bir plakaya veya önceden etiketlenmiş 5 mL polipropilen tüplere aktarın.
- 96 oyuklu V-alt plakadaki her bir kuyucuğu 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde 100 μL %1 Paraformaldehit (PFA) ile durulayın ve 96 oyuklu U-alt plakadaki ilgili kuyucuklara aktarın veya etiketli 5 mL polipropilen tüpler adım 2.1'den itibaren %0.5 PFA/kuyucuk veya tüp. Çok kanallı bir pipet kullanarak iyice karıştırın, plakayı alüminyum folyo ile örtün ve hücreleri sabitlemek için inkübatörde 30 dakika bekletin.
- Floresan ayarlarıyla birlikte yan ve ileri saçılmayı kalibre etmek için boyanmamış K562 hücrelerini çalıştırarak akış sitometresini hazırlayın (örneğin Malzeme Tablosuna bakın). Gerekli olan tek floresan kanalı FL1'dir, çünkü GFP hücrelerden yayılan tek floresandır. Her örnekten ~ 30.000–50.000 hücre elde edin.
not: Tek bir floresan okuyabilen herhangi bir akış sitometresi, verileri elde etmek için kullanılabilir, çünkü RVP'lerle enfekte olmuş hücreler GFP'nin varlığından dolayı yalnızca yeşil floresan yayacaktır ve başka bir floresan kanalına ihtiyaç yoktur.
3. Veri Analizi
- Herhangi bir akış sitometrisi analiz yazılımı kullanarak akış sitometresinde elde edilen verileri analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).
- İlk geçidi, tek hücreleri dahil etmek ve otomatik floresan çiftleri analizden hariç tutmak için FSC-A (ileri saçılma – alan) ve FSC-H'ye (ileri saçılma – yükseklik) göre ayarlayın. Ardından, herhangi bir otofloresan kalıntıyı dışlamak için SSC-A'ya (yan saçılma – alan) karşı FSC-A'ya dayalı tek kapılı hücreleri kapılayın.
- SSC-A ve GFP-A'ya dayalı GFP ekspresyonu için SSC-A ve FSC-A kapılı hücreleri analiz edin. Serumun her seyreltilmesi için GFP + hücrelerinin yüzdesini belirleyin ve GFP + hücrelerinin etrafına bir kapı ayarlayarak numuneleri kontrol edin.
- Her serum numunesi seyreltme ve kontrol kuyucukları için GFP + hücrelerinin ortalama yüzdesini üçlü kuyucuklardaki GFP + hücrelerinin toplam yüzdesini 3'e bölerek belirleyin.
- Her seyreltme için serum numunelerindeki GFP + hücrelerinin ortalama yüzdesini, RVP'ler (serum örneği yok) kontrol kuyucukları ile RPMI-10'daki GFP + hücrelerinin ortalama yüzdesine bölerek enfeksiyonun kat artışını hesaplayın.
- Seyreltmeye (x ekseni) karşı katlama artırma (y ekseni) grafiğini çizin ve ANOVA kullanarak istatistiksel analiz yapın ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Tukey'in post-hoc testini izleyin.
