1. Raportör Hücreleri Kullanarak Potansiyel TLR4 Nano İnhibitörlerinin Taranması
NOT: TLR4 sinyalizasyonu, MyD88'e bağımlı kara TRIF'e bağımlı yolların her ikisini de kullandığından, çok çeşitli TLR sinyal yollarını kapsayacak şekilde birincil hedef olarak seçilir. THP-1-XBlue raportör hücreleri esas olarak NF-κB / AP-1 aktivasyonunu incelemek için kullanılırken, THP-1-Dual hücreleri TRIF'e bağlı sinyal iletiminden IRF aktivasyonu içindir.
- Taramadan önce bir doz-yanıt eğrisi oluşturarak optimal LPS dozunu belirleyin.
- Çalışan LPS çözeltisini R10 ortamında 0.01 - 100 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin (log10 ölçeğinde seyreltme yapın). Plaka tasarımını yerleştirin ve 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir kültür plakasında seyreltme yapın. Seyreltmeden sonra her kuyucuğun en az 110 μL çözeltiye sahip olduğundan emin olun.
- Bir vakum aspiratörü kullanarak kültür ortamını hücre tohumlu plakadan nazikçe çıkarın.
- Seyreltme plakasında (1.1.1) hazırlanan R10 besiyeri içeren LPS'yi numunelerin yerleşimine göre kültür plakasına aktarın. Plakayı 37 ° C'de (bir hücre kültürü inkübatöründe) 24 saat inkübe edin.
- 24 saatte, süpernatanları (80 μL / kuyucuk) dikkatlice 96 oyuklu yeni bir 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakaya aktarın. Kolorimetrik ve/veya lusiferaz lüminesans testini bu solüsyonlar üzerinde hemen yapın veya test geliştirmeden önce 4 °C (birkaç saat) veya -20 °C (gün) sıcaklıkta saklayın.
not: Plaka düzeninin tasarımı, deney ve veri analizi için basit ve anlaşılır olmalıdır. Her koşul için 2-4 kopya düşünülmelidir. Her zaman bir negatif kontrol grubu (LPS null) ekleyin. NF-κB/AP-1 aktivasyonu için THP-1-XBlue hücrelerinin kullanılması önerilir, çünkü Çift hücreler makrofajlara farklılaştıktan sonra nispeten yüksek bir NF-κB/AP-1 aktivasyonu arka planına sahiptir. Bununla birlikte, hem NF-κB / AP-1 hem de IRF aktivasyonunu raporlamak için Çift hücreleri kullanmak mümkündür.
- NF-κB / AP-1 aktivasyonu için kolorimetrik testi ve IRF aktivasyonu için lusiferaz lüminesans testini geliştirin.
- NF-κB/AP-1 aktivasyonunu değerlendirmek için, her numunenin 20 μL süpernatantını yeni bir 96 oyuklu düz tabanlı kültür plakasına aktarın ve her oyuğa 180 μL önceden ısıtılmış SEAP substrat çözeltisi ekleyin. Renk gelişimine izin vermek için plakayı 37 ° C'de 1 - 2 saat inkübe edin (pembe ila koyu mavi). Emilimi 655 nm'de bir plaka okuyucuda toplayın.
Dikkat: Kuluçka süresi, renk gelişimine bağlı olarak değiştirilebilir (30 dakikadan gece boyunca inkübasyona kadar). Renk gelişiminin doygunluğundan (OD >3) kaçınırken en koyu rengin optik yoğunluğunun (OD) 1'in üzerine çıkmasını beklemeniz önerilir.
- IRF aktivasyonunun analizi için, her numunenin 10 μL süpernatantını 96 oyuklu şeffaf düz tabanlı beyaz bir plakaya aktarın. Lusiferaz çözeltisini (50 μL) ekleyin ve hemen lüminesansı iyice toplayın.
not: Kuyudan kuyuya ve plakadan plakaya lüminesans okumasında tutarlılığı sağlamak için otomatik enjeksiyon işlevine sahip bir lüminesans plaka okuyucusunun kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Substrat çözeltileri manuel olarak enjekte edilirse, lütfen her kuyucuk için tutarlı bir inkübasyon süresi ve okuma kurulumu sağlayın.
- Tarama testini 10 ng / mL LPS stimülasyonu ile (1.1'e göre) çeşitli peptit-GNP hibritleri üzerinde gerçekleştirin. Raportör tahlil geliştirme için 1.2'deki aynı prosedürü izleyin.
- Santrifüjleme yöntemini kullanarak peptit-GNP hibritlerini bir R10 ortamında 200 nM'ye konsantre edin. 20 hacim hibrit çözeltiyi (10 nM) 18.000 x g'da 30 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanları dikkatlice atın. Hibritleri (tüpün altındaki) bir tüpe toplayın, PBS ile iki kez yıkayın ve hibritleri R10 ortamının bir hacminde yeniden süspanse edin.
- Konsantre hibritlerin ve R10 ortamı içeren LPS'nin (20 ng/mL) eşit hacimlerinde, hibritlerin ve LPS'nin nihai konsantrasyonunun sırasıyla 100 nM ve 10 ng/mL olacak şekilde karıştırılmasını sağlayın.
- Kültür ortamını kültürlenmiş plakadan çıkarın ve her bir oyuğa 100 μL karışık çözelti ekleyin (her koşul için 3 kopya); bir negatif kontrol (sadece orta) ve bir LPS kontrolü (hibritler olmadan 10 ng / mL LPS) içerir.
- 37 ° C'de 24 saat inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğun ortamını bir tüpe aktarın ve tüpleri 18.000 x g, 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanları (50-80 μL / tüp) 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya toplayın ve raportör testini 3.2.
'da açıklandığı gibi gerçekleştirin
Dikkat: Santrifüjlemeden sonra süpernatanları atarken, tüpün altındaki hibritleri çalkalamayın.
not: Adım 1.3.4'teki santrifüjleme, içselleştirilmemiş nanopartikül hibritlerini kültür ortamından çıkarmak için çok önemlidir ve hibritlerin kolorimetrik/lüminesans okumaları ile girişimini önleyebilir. Bunun nedeni, altın nanopartiküllerin boyutlarına ve aglomerasyonlarına bağlı olarak geniş dalga boylarında ışığı emmesidir.
2. Potansiyel Adayların Engelleyici Etkisinin Doğrulanması
NOT: Taramadan elde edilen potansiyel adayların engelleyici etkisini doğrulamak için iki yaklaşım kullanılır. Birincisi, uyarıcıların (LPS) doz tepkilerini sabit bir hibrit konsantrasyonda (veya tam tersi) incelemektir; diğeri ise immünoblotlama yoluyla NF-κB/AP-1 ve IRF3 sinyallerinin inhibisyonuna doğrudan bakmaktır.
- Birinci yaklaşımda, raportör testini 1.3'te açıklanan aynı prosedürleri izleyerek 100 nM kurşun hibritleri ve 1 ng / mL ve 10 ng / mL'de iki LPS konsantrasyonu ile gerçekleştirin. Karşılaştırma için hibrit kontrol olarak etkin olmayan bir hibrit (tarama sonuçlarına göre) ekleyin.
- İmmünoblotlama yaklaşımı için lütfen standart deneysel prosedürleri takip edin.
- THP-1 hücrelerini R10 ortamında kültürleyin, hücreleri 12 oyuklu bir kültür plakasına (2 x 106 hücre / oyuk) tohumlayın ve hücreleri 24 saat boyunca 50 ng / mL PMA ile tedavi ederek ve ardından 2 gün dinlendirerek makrofajlara ayırın.
- Hücre farklılaşmasından sonra, zamanla (4 saate kadar) hibritler olsun / olmasın (100 nM) 10 ng / mL LPS ile hücreleri uyarın. Çeşitli zaman noktalarında (0, 5, 15, 30, 60, 120 ve 240 dakika), hücre lizatlarını immünoblotlama için hazırlayın. Etkin olmayan bir karmayı denetim olarak dahil edin.
- Kurşun hibritlerin NF-κB ve IRF3'ün aktivasyonu üzerindeki inhibitör etkisini incelemek için IκBα, fosforile p65 ve fosforile IRF3 sinyallerini araştırın. β-aktin ve toplam IRF3 sinyallerini dahili kontroller olarak inceleyin.
not: Sinyal iletimi genellikle raportör enzimler SEAP ve lusiferazın (24 saat) ekspresyonundan çok daha hızlı (birkaç saat içinde) gerçekleşir. Başka bir doğrulama yöntemi olarak test edilen hibritlerin 24 saatte bir canlılık testinin de yapılması şiddetle tavsiye edilir.
>3. TLR Özgüllüğünün Değerlendirilmesi
NOT: Kurşun peptit-GNP hibritinin TLR özgüllüğünü araştırmak için TLR2, TLR3 ve TLR5 dahil olmak üzere diğer TLR sinyal yolları test edilir. TLR7, 8 ve 9 hariç tutulur çünkü THP-1'den türetilen makrofajlar, makrofajlarda TLR7, 8 ve 9 ekspresyonunun olmaması nedeniyle bu TLR'lerin uyarılmasına iyi yanıt vermez.
- 1.1 ve 1.2'de aynı prosedürü takiben optimal konsantrasyonu elde etmek için her iki raportör hücreden türetilmiş makrofajlarda TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I:C) ve TLR5'e (flagellin) özgü ligandların çeşitli konsantrasyonlarını (1 ng/mL ila 25 μg/mL) test edin.
- Hücreleri, 1.3'te açıklanan deneysel prosedüre göre kurşun hibritin inhibitör özgüllüğünü değerlendirmek için 3.1'den elde edilen konsantrasyonda kurşun hibrit (100 nM) ve her bir TLR ligandının karışımları ile muamele edin. Etkin olmayan karmayı karşılaştırma için bir kontrol olarak dahil edin.
